调控因子SlyA和RfaH在E.coli K4合成果糖软骨素中的生理作用

利用基因工程手段过量表达E.coli K4荚膜多糖(K4CPS)合成途径中相关代谢调控因子Sly A和Rfa H,以构建高效合成K4CPS的菌株。结果发现:sly A和rfa H基因的单独过量表达和共表达重组菌的K4CPS的产量较对照菌分别提高了81.8%、46.5%和153.8%;甘油比消耗速率较对照菌降低了12.5%、18.8%和31.3%,而乙酸含量则较对照菌降低了98.6%、39.7%和91.6%。因此,调控蛋白Sly A和Rfa H的过量表达能够大幅度提高E.coli K4的K4CPS合成,并增强菌体对甘油的利用率,而乙酸合成明显降低。而与单独表达策略相比,共表达策略能够更加有效地增强菌体合成K4CPS的能力。     

启动子工程改造大肠杆菌K4生产果糖软骨素

为了进一步提高大肠杆菌K4发酵生产果糖软骨素(K4CPS)的产量,将合成基因簇region 3启动子(PR3)3'端非翻译区(UTR)进行缺失突变,研究其对突变菌株K4CPS合成的影响。研究表明:在ops序列(RfaH蛋白结合位点)存在时,PR3启动子强度和K4CPS产量与UTR的长度变化无关;但ops序列缺失时,UTR的延长可导致PR3启动子的强度和K4CPS产量均低于对照菌株;反之,UTR的缩短能显著提高PR3启动子的强度,进而使K4CPS产量比原菌增加了46%,达到751 mg/L。     

AtCPS V326M突变显著影响赤霉素合成

赤霉素(gibberellins,GA)是植物激素之一,调控植物生长和发育.植物体中赤霉素合成量直接影响植物的形态和生物量.在赤霉素合成途径中,柯巴基焦磷酸合酶基因(copalyl diphosphate synthase,CPS)是第一个合酶基因,该基因突变会严重影响赤霉素合成量.本研究通过对根和下胚轴缩短、晚花、丛...     

基于基因组序列的脑膜炎奈瑟菌分型方法

[目的]建立并评估1种适宜的脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,Nm)基因组分子分型方法.[方法]本研究以125株代表性Nm菌株的基因组序列为对象,建立了基于核心基因SNP的基因组分型方法,并与pubMLST网站公布的MLST和cgMLST分型方法进行比较.[结果]基于核心基因SNP的基因组分型...     

抑制性消减杂交法筛选炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因

为了筛选炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因,本研究以培养36 h(抗生素分泌前)的炭样小单孢菌JXNU-1菌体所合成c DNA为Driver,以培养108 h(抗生素分泌后)的菌体所合成的c DNA为Tester,构建炭样小单孢菌JXNU-1分泌抗生素前后的差异c DNA消减文库,筛选差异表达基因,荧光定量PCR验证其表达量,生物信息学方法分析其功能。研究结果表明,经抑制性消减杂交筛选得到5个与抗生素合成相关的差异表达基因;比照炭样小单孢菌JXNU-1全基因组序列,将所获5个基因定位到4个生物合成基因簇中,最后确定了炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素生物合成相关的基因簇。本研究为阐明炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素的生物合成机制提供了实验依据。     

大鼠肝含5~1端氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因的克隆

为研究氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPS Ⅰ)基因表达的调控,我们根据CPS Ⅰ编码1—10氨基酸的mR NA顺序,合成一个30碱基的寡聚核苷酸。以它作为探针从大鼠肝基因库中筛选出一个阳性克隆,λ10。对其中4.5kb插入片断的内切酶谱及部分核苷酸序列测定证明它确含5′上游CPS Ⅰ基因DNA序列。     

肺炎克雷伯菌RcsAB蛋白对荚膜多糖相关基因wcaJ、wcaG和magA的调控关系

荚膜多糖(CPS)是肺炎克雷伯菌(Klebssiella pneumoniae)重要的毒力因子.Rcs系统是肠杆菌科(En-terobacteriacese)中重要的双组分信号转导系统,RcsAB是其中主要的转录调控蛋白.本研究选取了肺炎克雷伯菌NTUH-K2044 cps基因簇上的3个基因(wcaJ,wcaG和magA),研究RcsAB对上述3个基因可能存在的调控关系.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和LacZ报告基因融合试验来确认RcsAB是否能够调控上述3个基因的转录表达.进而用凝胶阻滞试验(EMSA)验证RcsAB能否直接结合在靶基因的启动子区,对靶基因进行直接调控.结果表明RcsAB能够正向调控上述3个基因的转录表达,EMSA的结果提示RcsAB对这3个基因可能是通过间接的方式进行调控.RcsAB蛋白可能通过间接调控荚膜多糖基因wcaJ、wcaG和magA的转录,从而影响菌株的荚膜多糖表型.     

肺炎克雷伯菌RcsAB蛋白对荚膜多糖相关基因wcaJ、wcaG和magA的调控关系

荚膜多糖(CPS)是肺炎克雷伯菌(Klebssiella pneumoniae)重要的毒力因子.Rcs系统是肠杆菌科(En-terobacteriacese)中重要的双组分信号转导系统,RcsAB是其中主要的转录调控蛋白.本研究选取了肺炎克雷伯菌NTUH-K2044 cps基因簇上的3个基因(wcaJ,wcaG和magA),研究RcsAB对上述3个基因可能存在的调控关系.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和LacZ报告基因融合试验来确认RcsAB是否能够调控上述3个基因的转录表达.进而用凝胶阻滞试验(EMSA)验证RcsAB能否直接结合在靶基因的启动子区,对靶基因进行直接调控.结果表明RcsAB能够正向调控上述3个基因的转录表达,EMSA的结果提示RcsAB对这3个基因可能是通过间接的方式进行调控.RcsAB蛋白可能通过间接调控荚膜多糖基因wcaJ、wcaG和magA的转录,从而影响菌株的荚膜多糖表型.     

茶树内生草螺菌ZXN111生长素合成及其对云抗-10号植物的促生功能

【目的】以紫娟茶树分离的内生菌水生草螺菌ZXN111为研究对象,通过分子遗传学方法证实该菌株植物生长素吲哚3-乙酸(IAA)合成的主要分子途径。【方法】参考草螺菌基因组信息中IAA合成基因簇,选取与IAA合成密切相关的候选基因,即芳香族氨基酸转氨酶基因(tyrb),通过基因插入突变与基因互补方法,结合茶树组培苗体内促生能力分析,初步验证水生草螺菌生长素合成的主要机制。【结果】植物生长素IAA合成候选基因tyrb突变后,突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB 48 h的IAA合成量显著低于野生型菌株ZXN111,且tyrb基因互补后,互补株tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)的IAA合成能力得到了显著恢复。茶树促生实验发现,突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB接种组的茶树组培苗根长、根重及植株鲜重指标上均显著低于野生菌处理组。【结论】水生草螺菌ZXN111有多条IAA合成途径,其中的吲哚-3-丙酮酸(IPA)是最主要途径,其生长素合成对寄主茶树具有显著的促生功能。     

钩端螺旋体聚Beta羟基丁酸(PHB)生物合成途径分析

【目的】致病型问号钩端螺旋体(问号钩体, Leptospira interrogans)和腐生型双曲钩体(L. biflexa)能够大量合成菌体内贮藏物, 这可能是钩体在营养贫瘠环境中长时间存活的主要原因之一。本研究对钩体聚Beta羟基丁酸(PHB)贮藏物进行定性定量测定, 通过基因组分析补充定义PHB合成主要功能基因, 并采用分子生物学方法初步证明PHB合成途径的完整性, 为进一步研究PHB合成与钩体抗逆能力的关系奠定基础。【方法】采用脂类特异性尼罗红染色法和浓硫酸氧化-紫外分光光度计测定法, 对问号钩体和双曲钩体的PHB贮藏物进行定性定量测定; 采用生物信息学方法(BLAST和InterProscan/InterPro2Go), 通过同源性分析和功能结构域搜索寻找钩体基因组中的PHB合成相关基因; 最后采用克隆测序和定量RT-PCR技术检测相关基因表达情况, 初步验证生物信息学预测结果。【结果】尼罗红染色和氧化后比色定量实验证明钩体合成细菌常见贮藏物PHB, 问号钩体合成量为菌体干重的42%?45%, 双曲钩体合成量为64%?68%。尽管已公布的多个钩体基因组中均没有定义完整的PHB合成途径, 但本研究通过综合生物信息学分析, 在问号钩体和双曲钩体中鉴定了PHB合成途径的主要功能基因(phbC)。克隆测序和定量RT-PCR证实钩体转录表达大部分PHB合成相关基因(phbA/B/C), 说明钩体内该生物途径基本完整, 且部分高水平表达基因可能是钩体主要的PHB合成相关基因。【结论】问号钩体和双曲钩体均可合成PHB贮藏物, 且具有基本完整的PHB合成生物途径。