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用蛋白质工程方法改变葡萄糖异构酶最适pH和最适温度 总被引:3,自引:2,他引:3
用寡核苷酸诱导的定点突变方法构建了葡萄糖异构酶基因的突变体(N184D和A198C)。含突变体的重组质粒pTKD-GI1(N184D)和pTKD-GI2(A198c)在E.coliK38菌株中表达,用DEAE-Sepharose FF和Sephacryl S-300HR柱层析分离纯化突变酶。与野生型葡萄糖异构酶比较实验表明:(1)突变酶N184D的最适pH值下降了1个单位;等电点下降了0.6个单位 相似文献
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G138P定点突变对葡萄糖异构酶热稳定性的改善 总被引:18,自引:0,他引:18
通过分子设计,确定Gly138为改善葡萄糖异构酶(GI)热稳定性的目标氨基酸。用双引物法对GI基因进行体外定点突变,构建了GI突变体G138P。含突变体的重组质粒pTKD-GIG138P在E.coliK38菌株中表达。GIG138P与野生型GI比较实验表明:(1)GIG138P的热失活半衰期约是野生型GI的2倍;(2)GIG138P的最适反应温度提高了10 ̄12℃;(3)GIG138P的比活与野生 相似文献
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葡萄糖异构酶(glucoseisomerase,GI)是使用量最大的工业酶之一,可用于高果糖浆的生产,也可以用含木聚糖物质及废料为底物发酵生产乙醇,具有重要的经济价值.本文选择了表达载体pBV220[1],利用PCR方法删除了原表达质粒pTKDGI1中GI结构基因5′端多余的核苷酸,并添加了合适的酶切位点,重新构建了能在大肠杆菌DH5α中高效表达GIG138P的表达质粒pBZGI1.传代实验表明,新表达体系的稳定性明显优于原表达体系.粗酶液经热处理、DEAESepharoseFF和分子筛Se… 相似文献
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棒状杆菌2,5—DGK还原酶基因在欧文氏菌中的表达 总被引:4,自引:0,他引:4
将能够在大肠杆菌内高效表达棒状杆菌2,5-DKG还原酶I基因的质粒pBL4改造成为具有链霉素抗性的质粒pBLS,采用改进的感受态转化法将pBLS导入能够利用葡萄糖高产2,5-DKG的欧文氏菌SB125中,通过提高温度诱导,经SDS-PAGE分析2,5-DKG还原酶I获得了高效表达,占菌体总蛋白的22%,不形成包涵体。体外酶活测定结果表明表达的酶具有较高的活力。同时,通过凝胶活力染色发现了宿主欧文氏 相似文献
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沈炳福 《植物生理与分子生物学学报》1994,(2)
苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)nodC蛋白是结瘤基因nodC编码的43kD多肽(NodC)。应用噬菌体T7RNA聚合酶/启动子表达系统.pT7-5作为载体质粒.构建了带有nodC基因的PBF6克隆.经诱导在大肠杆菌JAKE中获得表达,过量生成NodC,占细胞总蛋白量的5%。经细胞膜蛋白组份的分离,Bio-gel柱层析,SDS-PAGE电泳等获得了比较纯化的NodC。 相似文献
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苜蓿根瘤菌nodC蛋白是结瘤基因nodC编码的43kD多肽。应用噬菌体T7RNA聚合酶/启动子表达系统,pT7-5作为载体质粒,构建了带有nodC基因的pBF6克隆,经量生成NodC,占杆菌JAKE中获得表达,过量生成NodC,占细胞总蛋白量的5%。经细胞膜蛋白组份的分离,Bio-gel柱层析,SDS-PAGE电泳等获得了比较纯化的NodC。 相似文献
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利用PCR扩增得到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆pGEM-T构建成GM-CSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对72RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴 相似文献
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应用多聚酶链反应(PCR),直接从SIV感染的猴艾滋病(SAIDS)模型猴的外周血淋巴细胞总DNA中扩增出767bp的SIV核心蛋白P27基因片段。扩增产物经EcoRI及SalI双酶切后,克隆入相同酶切的表达质粒pBV220中,获得含SIV核心蛋白基因片段的重组质粒pBVSG,并进行DNA序列分析。用该重组质粒转化大肠杆菌DH5a经筛选、增殖及42℃温度诱导,SDS-PAGE表明外源基因表达蛋白含量占菌体总蛋白14.5%,Western-blot证实表达产物能被SIVP27单克隆抗体及SAIDS模型猴血清中特异性抗体识别。 相似文献
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应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达 总被引:4,自引:0,他引:4
为了观察硫氧还蛋白(TrxA)促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的作用,我们从质粒pET-32a(+)上克隆了trxA基因,构建了TrxA表达质粒pT-TrxA。将该质粒与其它蛋白基因的表达质粒共同转化E.coli并同时获得表达。结果表明,共表达TrxA可以明显促进外源蛋白,如甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、PTHrP受体(PTHrP-R)的血管内皮生长因子(VEGF)的可溶性表达。说明共表达 相似文献
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应用DNA重组技术,将HuIFN-β基因插入到质粒pKKH的tac启动子下游,转化大肠杆菌JM101和JM103,经IPTG诱导,表达HuIFN-β,收集并裂解细菌,用Wish-VSV系统细胞病变抑制法检测生物学活性为2.18×108-8.7×108IU/L菌液。经初步纯化SDS-PAGE电泳可见分子量为20KD较纯的表达带。 相似文献
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大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化… 总被引:1,自引:1,他引:0
本文从含ArgRS306KR基因args306KR的pUC18重组质粒的大肠杆菌TG1转化子中经DEAE-Sephacel和Blue-Sepharose两步柱层析,得到电泳一条带的ArgRS306KR。纯酶的比活为2790单位/毫克。该酶氨酰化和ATP-PPi交换活力的最适PH分别为PH8.3和PH7.5。氨酰化活力对ATP、Arg和tRNA的Km分别2.6mmol/L、14.0μmol/L和5. 相似文献
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在大肠杆菌中,80%的3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮-7-磷酸(3-deoxy-D-arabino-heptulosoate 7-phosphate,DAHP)合酶由aro基因编码。分别以大肠杆菌K12及其抗苯丙氨酸类似物的突变体总DNA为模板,以PCR方法扩增得到aroG基因及其突变。基因测序结果表明抗苯丙氨酸灯似物的突变体,其aroG基因核苷酸625位发生了T→C的点突变,从而使AroG蛋白的20 相似文献
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日本血吸虫中国大陆株TPI基团的克隆及其表达产物特性 总被引:1,自引:1,他引:1
磷酸丙糖异构酶(TPI)是血吸虫病疫苗重要的候选抗原基因之一。参考日本血吸虫已发表的TPI cDNA序列,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR法快速克隆出一大小约800bp的DNA片段。DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段即为日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(SjTPIc)基因。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T中,表达的GST融合蛋白分子量约54kD。用谷胱甘肽琼脂 相似文献
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土曲霉金色变种AT8951菊粉酶的纯化和性质的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
土曲霉金色变种AT8951菊粉酶粗酶液经硫酸铵分段沉淀、DEAECeluloseDE32离子交换、超滤、SephadecG-150凝胶过滤和FPLC,获得两个菊粉酶组分EI和EII,经分析型FPLC和PAGE鉴定为单一纯和分析纯。EI分量为66KD,适适作用温度和PH分别55℃和5.8;EII分子量为56KD,最适作用温度为57℃,最适PH为6.0。EI和EII皆为糖蛋白,多糖含量分别为24.7% 相似文献
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利用来自假单胞菌的GL-7-ACA酰化酶的信号肽和表达元件基因片段构建了GL-07-ACA酰化酶的分泌型高表达质粒pTrcCA1S和pKKCA1S,其中pTrcCA1S为IPTG诱导型质粒,pKKCA1S为组成型质粒。pTrcCA1S和pKKCA1S转入受体菌TG1中都可高表达GL-7-ACA酰化酶基因并将表达产物转运到周质空间,完整细胞酰楷酶比活力分别为23.9单位每克菌体和18.3单位每克菌体 相似文献