青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的组织特异性表达

为了探索文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶AdoHcyase基因在文昌鱼组织中的表达分布情况,利用组织原位杂交技术,以地高辛标记的反义RNA为探针,检测了文昌鱼AdoHcyase基因在组织中的表达分布特点.结果表明,AdoHcyase基因在雌性文昌鱼的卵巢、肝盲囊和后肠杂交信号十分强烈,在内柱、鳃等组织中也有微弱信号表达,...     

S-腺苷高半胱氨酸水解酶的晶体结构及其催化机制

AdoHcy水解酶是一重要的广谱抗病毒药物靶标,对其结构,特别是三维空间结构的研究,有助于深入了解和阐述其功能,并为实现基于靶标结构的药物设计和筛选奠定基础。该文介绍近年来有关AdoHcy水解酶晶体结构的研究成果。     

落地生根S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及生物信息学分析

为了解落地生根(Kalanchoe daigremontiana)的SAHH基因功能,采用RACE技术从其叶片克隆了SAHH的全长c DNA序列,命名为Kd SAHH。结果表明,Kd SAHH全长为1748 bp,含1458 bp完整的开放阅读框(ORF),推测编码485个氨基酸。预测落地生根SAHH蛋白分子量约为53 k Da,理论等电点为5.59~5.682。Scanprostie和DNAstar预测表明,落地生根SAHH蛋白在进化上非常保守,与苜蓿的亲缘关系较近。以黄羽扇豆为模板,利用SWISS-MODLE和Phyre程序模拟的落地生根SAHH蛋白亚基三维结构有一定差异。这些为落地生根Kd SAHH的表达和功能研究奠定了基础。     

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因表达载体的构建及表达纯化

为了在原核细胞中表达青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtaunese S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adeno-sylhomocysteine hydrolase,SAHH),采取构建文昌鱼SAHH基因的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-SAHH的方法,转化入大肠杆菌JMl09感受态细胞中,IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化.结果经SDS-PAGE分析,重组质粒在JM109中表达并纯化得到的融合蛋白大约为70 kDa,成功构建了文昌鱼SAHH基因原核表达载体,且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白.     

热水提取酿酒酵母中S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究

研究了采用热水法直接提取酿酒酵母胞内产物S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）北京,并且通过实验对影响SAM抽提的5个条件：抽提温度、抽提时间、热水用量、搅拌转速、硫酸用量等进行了优化。得出的最佳实验条件为：温度70℃、每30g湿菌体加入热水100mL、硫酸浓度0．25mol／L、搅拌转速160r／min,此时SAM的抽提率可达91．5％。与其他方法相比,该方法耗时少、仪器简单、抽提液中S-腺苷-L-甲硫氨酸质量浓度高、经济且无污染。     

储存条件对表达马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA的大肠杆菌生物活性的影响

【目的】将RNA干扰应用于害虫防治领域,通过饲喂表达ds RNA的转基因植物或表达ds RNA的细菌,可沉默特定基因进而控制害虫,为农业害虫防治开辟一个新领域。而表达ds RNA的细菌能否有效储存是决定此项技术实际应用的关键。【方法】用﹣20℃冻存的表达马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)ds RNA的大肠杆菌E.coli,饲喂马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata(Say)2龄幼虫,检测不同时间储存、灭活与否的活性变化,明确其储存条件。【结果】大肠杆菌﹣20℃储存24 h后生物活性优于新鲜菌,储存48 h后效果减弱,而载体大肠杆菌是否灭活对活性影响不大。【结论】ds RNA大肠杆菌发酵液在﹣20℃条件下可以短暂储存。     

南极嗜冷假单胞菌7197 S- 腺苷同型半胱氨酸水解酶 ( SAHH) 基因的克隆与序列分析

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株耐冷菌株7197,其16S rDNA序列分析表明该菌株属于假单胞菌属（Pseudomonas）。作者通过设计引物,从该菌的全基因组DNA中克隆到编码S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAHH）的完整ORF,全长为1424bp。使用DNAMAN（5,1）软件对全长ORF为1424bp的SAHH基因进行分析,SAHH基因编码一个由474AA残基组成、分子量预计为52523Da的SAHH蛋白质,与Psychrobacter sp．273—4的SAHH有96．84％的相似性;与Acinetobacter sp．ADP1的SAHH有79％的相似性;与Pseudomonas fluorescens Pf-5的SAHH有75％的相似性。     

表达人高致病性禽流感病毒H5N1(安徽株)结构基因的DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫应答分析

本研究旨在研发经济、高效的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗并优化免疫方案。首先优化并合成H5N1(安徽株)的血凝素基因(HAop)和神经氨酸酶基因(NAop)并证实其正确表达,再构建含有H5N1(安徽株)结构基因的多个单顺反子(HAwt、HAop和NAop)和双顺反子(HAop/M2和NAop/M1)DNA疫苗质粒。随后,采用不同途径的体内电转法在第0周和第3周2次免疫Balb/C小鼠,初步分析了抗原特异性体液免疫(HA血凝抑制抗体,NA特异性抗体,中和抗体)和细胞免疫应答(IFN-γELISpot)的特点。结果表明:含有优化血凝素基因(HAop)和优化神经氨酸酶基因(NAop)的DNA疫苗可以快速激发较强的免疫应答,尤其是细胞免疫应答;皮内电转所激发的体液免疫应答强于肌肉电转。本研究为新型H5N1疫苗的研发以及免疫方案的优化奠定了基础。     

大鼠睾丸特异表达基因Ube1的分离鉴定及生物学特征

本研究采用抑制性消减杂交(suppression subtracfive hybridization, SSH)和cDNA快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术从大鼠A型精原细胞和粗线期精母细胞中成功克隆出大鼠泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme)基因Ube1 (GenBank登录号EF690356).该基因序列全长3433 bp,其中开放阅读框有3171 bp,编码一个含1057个氨基酸的蛋白质.Blast比对显示,Ube1与小鼠泛素激活酶基因Ubely1的同源性为93%,与人泛素激活酶基因UBE1的同源性为82%.Ube1基因编码的蛋白质含泛素激活酶信号位点和泛素激活酶活化位点,这些位点也存在于人类和小鼠的泛素激活酶1中.RT-PCR分析显示,Ube1在睾丸中大量表达,而在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脑、卵巢中没有表达.荧光定量PCR分析不同生精细胞中Ube1的表达,显示Ube1在A型精原细胞中大量表达,在粗线期精母细胞、圆形精子细胞和支持细胞中微弱表达.以上结果提示,Ube1是大鼠睾丸特异表达基因,可能通过参与泛素/蛋白酶体途径来影响精子发生.     

Real-time quantitative PCR assay for analysis of platelet glycoprotein IIIa gene expression

A quantitative detection assay for analysis of platelet glycoprotein GPIIIa gene expression is presented. The assay uses two fluorescently labeled TaqMan MGB probes to detect the polymorphic site in GPIIIa nucleotide sequence, leading to antigens HPA-1a and HPA-1b. In order to avoid the influence of DNA contamination on RNA quantification, a forward primer was constructed to span an exon-exon junction. The assay is therefore applicable to expression studies also in samples containing only a small amount of contaminating DNA. To standardize the amount of sample cDNA added to the reaction, amplification of endogenous control 18SrRNA was included in a separate well. The amplification validation experiment showed a high real-time PCR efficiency for HPA-1a, HPA-1b and 18SrRNA. Relative quantification was therefore performed using the comparative C(T) method. The assay was optimized on a reversely transcribed total RNA from platelets, and the specificity rate was determined by sequencing. The amount of cDNA at which amplification was still clearly detectable was 5 ng. This newly developed real-time quantitative PCR assay is a sensitive, reproducible and reliable method. It is suitable for studying different stages of megakaryopoiesis, monitoring molecular alteration in defective platelets and determining differences in the GPIIIa expression level between normal and pathological megakaryocytic differentiation pathways.