钝齿棒杆菌丙酮酸激酶的克隆表达及其对精氨酸合成的扰动影响

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA 5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。丙酮酸激酶(pyruvate kinase)是EMP途径的限速酶,对胞内能量产生和代谢流调节方面都有重要作用。为提高葡萄糖消耗速率以缩短发酵周期,以钝齿棒杆菌基因组为模板,克隆得到pyk基因并将其在C.crenatum SYPA 5-5中成功表达,葡萄糖平均消耗速率为1.71 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5提高33.5%,精氨酸产量和最大产率分别为43.32 g/L和0.55 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5分别提高20%和19.5%。结果表明,加强表达丙酮酸激酶能增强EMP途径,提高精氨酸产量。     

以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸整合型重组钝齿棒杆菌的构建

[目的]为了构建一株直接利用廉价的葡萄糖合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌,将来自于植物乳杆菌γ-氨基丁酸合成途径的关键酶谷氨酸脱羧酶基因(lpgad)在产谷氨酸菌株钝齿棒杆菌中进行整合表达,实现葡萄糖到GABA的一步法生产.[方法]运用PCR技术扩增得到带有tac启动子的谷氨酸脱羧酶基因tacgad.通过重叠PCR的方法获得钝齿棒杆菌精氨酸合成途径关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)基因内部缺失型基因△argB.利用自杀载体pK18mobsacB构建同源整合载体pK18-△argB::tacgad,以△argB的上下游序列为同源臂,通过两次同源重组将tacgad基因整合到钝齿棒杆菌基因组,同时将NAGK基因argB灭活,利用蔗糖致死基因sacB反向筛选标记筛选得到谷氨酸脱羧酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatum △argB::tacgad.重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物进行发酵,测定GABA含量.[结果]重组菌C.crenatum △argB::tacgad成功表达谷氨酸脱羧酶,同时阻断了精氨酸合成途径对谷氨酸到GABA代谢途径的竞争,粗酶液基本检测不到NAGK活性,发酵液无精氨酸合成.通过96 h发酵,重组菌可积累约8.28 g/L的GABA.[结论]本研究通过将谷氨酸脱羧酶基因定向整合到钝齿棒杆菌精氨酸合成途径的关键酶基因argB内部,成功表达谷氨酸脱羧酶的同时阻断竞争途径精氨酸的合成.本研究为实现直接利用葡萄糖合成GABA的一步法生产奠定了基础.     

钝齿棒杆菌argR基因缺失株构建及其缺失对精氨酸生物合成途径相关基因转录水平的影响

[目的]钝齿棒杆菌AS 1.542中argR基因编码的蛋白ArgR在精氨酸生物合成途径中扮演负调控的角色,但其对相关基因在转录水平的影响还未见报道.因此,本课题组构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并在转录水平上比较野生株与缺失株精氨酸生物合成途径相关基因的变化.[方法]采用无痕敲除的方法构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并采用荧光定量PCR方法分析缺失株和野生株精氨酸生物合成途径相关基因在转录水平的变化.[结果]利用pK18mobsacB质粒中蔗糖致死基因sacB反向筛选标记及PCR方法成功筛选到钝齿棒杆菌argR基因缺失株;荧光定量PCR结果表明,argR基因缺失株精氨酸生物合成途径中相关基因在转录水平获得大量提高,平均约上调162.13倍.[结论]钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径的相关基因受负调控蛋白ArgR的显著调控,但其基因的敲除并没有引起精氨酸产量发生明显的变化.     

结合缺陷型菌株显色法采用离子束诱变筛选高产L-精氨酸突变株

为快速高效筛选L-精氨酸高产突变株,建立一种缺陷菌株平板显色法并采用低能N+离子束对L-精氨酸生产用菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5进行诱变处理,通过上述平板显色法筛选获得高产突变株.对突变株进行摇瓶发酵实验,最终选育出一株L-精氨酸产量较高且产酸性能比较稳定的突变菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5-36.该菌株摇瓶发酵L-精氨酸产量可达35.85 g/L,比出发菌株提高了19.5％.因此,缺陷型菌株平板显色法可以用于快速、高效筛选高产L-精氨酸突变株.     

钝齿棒杆菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶的克隆表达分析及其重组菌的精氨酸发酵

N-乙酰鸟氨酸转氨酶 (EC 2.6.1.11,ACOAT) 是钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum精氨酸合成途径中的第4个酶,催化底物N-乙酰谷氨酸半醛生成产物N-乙酰鸟氨酸。为研究N-乙酰鸟氨酸转氨酶在钝齿棒杆菌中精氨酸合成中的作用,考察其酶学性质,对培养基成分和发酵过程工艺条件的优化提高精氨酸产量提供依据。从精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌SYPA 5-5染色体扩增获得ACOAT编码基因argD,全长1 176 bp,编码390个氨基酸,在Escherichia coli BL21(D     

钝齿棒杆菌精氨酸琥珀酸酶编码基因argH的克隆表达及其重组菌发酵产精氨酸研究

钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）SYPA是本实验室筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。精氨酸琥珀酸酶（AL）是精氨酸合成过程中的最后一个酶,催化底物精氨酸琥珀酸生成产物精氨酸。为进一步提高精氨酸产量,本文以钝齿棒杆菌基因组为模板,扩增得到其编码基因argH,全长为1434 bp,编码476个氨基酸,理论蛋白分子量大小为50.8 kDa,其与C. glutamicum ATCC 13032比对其同源性为99.4%,相差10 bp,3个氨基酸。将其在E.coli BL21(DE3)及C. crenatum SYPA中成功表达。利用载体pET-28a上的6×His?Tag选用Ni柱亲和层析纯化AL,纯化后获得的重组蛋白的比酶活达156.9mU/mg蛋白,总回收率为72.3%,对该酶的部分酶学性质进行了初步研究,并发现产物精氨酸对其具有反馈抑制作用。成功构建钝齿棒杆菌重组穿梭表达质粒pJC1-tac-argH并将其通过电击转化法转入C.crenatum SYPA中,加强其代谢途径中AL蛋白表达量,并对其发酵产精氨酸做了初步分析。结果表明与出发菌株相比,转化子在精氨酸琥珀酸酶酶活增强了66.8%的基础上精氨酸产量达40.9 g/L,比出发菌株产量的35.8 g/L提高了约14.2%。     

谷氨酸棒杆菌内源表达元件的筛选

【目的】构建谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体,筛选能够启动蛋白表达的序列片段。【方法】基于谷氨酸棒杆菌表达载体p XMJ19,利用Golden Gate新型克隆方法构建表达元件插入位点,使筛选的片段能够与报告基因快速无缝衔接,同时避免残留额外的序列对表达元件效果测试产生可能存在的干扰。对本课题组前期的谷氨酸棒杆菌BZH001高、中、低溶氧条件下的发酵样品转录组数据进行分析,筛选出稳定于高转录水平的6个基因,通过软件预测每个基因的启动子区域和5′UTR区域,两者构成能够启动基因表达的功能性元件,并将其从基因组中克隆出来。以增强型绿色荧光蛋白基因egfp作为报告基因,快速测量出表达元件的效果。【结果】获得5个不同效果的内源性表达元件,最好的元件插入探测载体后在谷氨酸棒杆菌中表达的荧光强度大于3 500 RFU/OD600。【结论】通过结合转录组数据,探测载体能够快速有效筛选表达元件,为将来人们对谷氨酸棒杆菌基因工程改造和生物系统的构建提供更多基础材料。     

钝齿棒杆菌中异源表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶合成L-鸟氨酸的研究

目的:对一株产鸟氨酸的钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5/△proB/△argF(SYPO-1)进行代谢工程改造,筛选不同细菌来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在大肠杆菌中克隆与表达,纯化后对其进行酶学性质的比较;将黏质沙雷氏菌Serratia marcescens Y213来源的Smarg E基因编码的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在L-鸟氨酸生产菌株C.crenatum SYPO-1中过量表达,进一步提高L-鸟氨酸的产量。方法:通过利用pDXW10穿梭质粒对不同来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰化酶进行克隆表达和酶学性质比较,选择性质最优来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶编码基因Smarg E在产L-鸟氨酸重组钝齿棒杆菌中表达,考察重组菌株发酵过程中参数的变化。结果:来源于S.marcescens Y213的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶比酶活最高为798.98U/mg,最适pH为7,最适温度为37℃,0.1mmol/L的Mg~(2+)、Li~+、Mn~(2+)促进酶的比酶活提高了50%;在钝齿棒杆菌中表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶酶活达到128.4U/ml,显著提高了钝齿棒杆菌中胞内乙酰基循环水平;5L发酵罐发酵重组菌株96h,L-鸟氨酸的产量达到38.5g/L,比出发菌株,L-鸟氨酸的产量提高了33.2%,产率达0.401g/(L·h)。结论:筛选出最佳来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶,在鸟氨酸生产菌株C.crenatum(SYPO-1)中过量表达,可以促进鸟氨酸的前体物质N-乙酰鸟氨酸的快速消耗,实现鸟氨酸的积累。     

乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响

【目的】研究乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响。【方法】在谷氨酸棒杆菌CGF2中异源表达als SD操纵子构建乙偶姻生产菌株CGT1,考察敲除乙酸生成途径cat和pqo对乙偶姻的影响。然后引入短乳杆菌的NADH氧化酶,在优化的溶氧条件下研究其对乙偶姻产量的影响。【结果】CGT1在摇瓶发酵中可积累6.27 g/L乙偶姻,敲除cat使乙偶姻产量显著提高30.94%,达到8.21 g/L;双敲除cat和pqo没有进一步提高产量。通过优化发酵的溶氧水平,乙偶姻产量达到10.06 g/L。在高溶氧水平下引入NADH氧化酶导致菌株的生长和糖代谢速率提高,但乙偶姻产量略有降低。在分批补料发酵中,重组菌株乙偶姻产量达到40.51 g/L,产率为0.51 g/(L?h)。【结论】在谷氨酸棒杆菌中阻断乙酸合成途径cat能够有效提高乙偶姻产量,NADH氧化酶在高溶氧水平下表达不利于乙偶姻的合成,需要进一步调节表达水平以确定其效果。     

受溶氧浓度调控的新型大肠杆菌表达系统

利用透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因在大肠杆菌中的转录过程受环境溶氧浓度调控,在贫氧条件下基因转录被激活的性质,构建了一个在贫氧条件下能高效表达外源基因的新型大肠杆菌表达系统。该表达系统包括一个古血红蛋白基因启动子元件控制T7RNA聚合酶基因表达的低拷贝质粒的宿主菌GJ100和另一个T7启动子控制外源基因表达的质粒载体。研究结果表明大肠杆菌本身的硫氧还蛋白,原核生物的金黄色葡萄球菌A蛋白IgG结合区(ZZ),真核生物的蛇神经毒素融合蛋白,鲑鱼降钙素六聚体,人白细胞介素Ⅱ和人尿激酶原等基因均能在该系统中获得高效表达。重组蛋白表达的水平可达细胞总蛋白的30％以上。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.