红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的β-葡萄糖苷酶基因的鉴定

宏基因组技术是挖掘微生物新酶的重要途径。通过构建红树林土壤微生物Fosmid文库,共获得了约100 000个阳性克隆,该文库外源插入片段平均长度约为30 kb,文库容量达3 Gb。通过对文库中10 000个克隆进行功能筛选,获得了17个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆,获得2个新颖的β-葡萄糖苷酶的基因,分别命名MhGH3和bgl66。生物信息学分析表明,MhGH3基因由1 992个碱基对组成,bgl66基因由2 025个碱基对组成。在氨基酸水平上,MhGH3和bgl66编码的蛋白质与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性分别为64%和55%。     

高糖土壤微生物宏基因组文库的构建及β-葡萄糖苷酶基因鉴定

采用宏基因组技术构建了高糖土壤微生物的DNA文库,该文库约含9万个克隆,文库外源DNA总容量为3.1×10~9bp。利用活性筛选策略,对文库进行筛选,获得11个β-葡萄糖苷酶的阳性克隆,并对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆和序列分析,获得两个编码新型β-葡萄糖苷酶的基因分别命名为:unbgl3A和unbgl3B。生物信息学分析表明:unbgl3A基因由2241个碱基对组成,unbgl3B基因由2292个碱基对组成。在核苷酸水平上,unbgl3A、unbgl3B与已知数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何相似性。在氨基酸水平上,与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的相似性分别为73%和69%。     

牙菌斑培养菌群宏基因组文库构建及抗生素耐药基因筛选

[目的]构建牙菌斑培养菌群宏基因组文库,筛选牙菌斑生物膜中细菌的抗生素耐药基因.[方法]采集20例无龋健康人的集合牙菌斑并进行厌氧培养.提取牙菌斑培养菌群宏基因组构建Fosmid文库.用卡那霉素、四环素及氨苄西林对文库进行筛选,并对筛选到的抗性Fosmid克隆进行末端测序、亚克隆构建、亚克隆测序和序列分析.[结果]构建了牙菌斑培养菌群宏基因组Fosmid文库,插入片段长度在36-48 kb间约有15 120个克隆,插入片段长度小于36 kb的约有3 360个克隆.筛选获得一个氨基糖苷类双功能修饰酶AacA-AphD基因、一个核糖体保护蛋白型四环素耐药基因tet (M)及一个C家族β-内酰胺酶基因.[结论]证实了可以通过构建宏基因组文库的方法来筛选牙菌斑培养菌群中的抗生素耐药基因.     

土壤微生物中新型β-葡萄糖苷酶的挖掘与鉴定

【背景】通过培养微生物来获得新β-葡萄糖苷酶因只有少部分微生物可以被培养而受到限制,但宏基因组学技术可以挖掘非培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶资源。【目的】利用宏基因组学技术挖掘土壤微生物来源的新型β-葡萄糖苷酶,并对其酶学性质进行初步分析。【方法】构建土壤微生物的宏基因组文库,利用七叶苷平板显色法对所构建的文库进行筛选获得阳性克隆,并对阳性克隆所含的β-葡萄糖苷酶基因进行异源表达和生物化学特性分析。【结果】通过筛选文库中的62万个克隆,获得一个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆,其插入片段中包含一个2 301 bp的ORF(YNBG3),蛋白同源性分析显示其属于β-葡萄糖苷酶第三家族。对YNBG3酶的生化分析确定其最佳反应温度为53°C,最适p H为5.2,有较好的热稳定性,对一定浓度范围内的DMSO、丙酮、乙醇等有机试剂有较好的耐受性,EDTA和尿素可增加该酶的活性。【结论】利用宏基因组学技术获得了一个有较好热稳定性及耐受一定浓度有机试剂和尿素的新β-葡萄糖苷酶。     

造纸废水纸浆沉淀物中未培养微生物纤维素酶基因的克隆和鉴定

提取纯化造纸废水纸浆沉淀物的宏基因组DNA并构建16S rDNA文库,系统发育分析显示该环境中存在大量的未培养细菌且具有种类的多样性。以柯斯质粒为载体构建了1个含10000个克隆的宏基因组文库,文库容量为3.53×108bp。筛选文库得到2个表达内切葡聚糖酶活性的克隆、3个表达外切葡聚糖酶活性的克隆和2个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆。从表达不同活性的克隆中分别挑选活性最强的进行鉴定,得到3个新的纤维素酶基因umcel5L、umcel5M和umbgl3D。umcel5L、umcel5M和umbgl3D分别编码产生内切葡聚糖酶、纤维糊精酶和β-葡萄糖苷酶,其编码产物与已报道的纤维素酶一致性最高的分别为43%、48%和46%。这是第一次采用未培养方法对造纸废水纸浆沉淀物中的细菌多样性进行分析并从中克隆纤维素酶基因的报道。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的β-葡萄糖苷酶基因umcel3G 的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶.本工作分 6 次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库,获得 1.26×105个克隆,文库含外源 DNA 的总长度约为 4.8×106kb.从文库中筛选到118个表达β-葡萄糖苷酶活性的独立克隆.发现其中 8 个克隆表达的β-葡萄糖苷酶在pH5.0、37℃条件下活性较强.对其中一个克隆进行了亚克隆,序列分析发现一个 2223 bp 的潜在的编码β-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF),其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个β-葡萄糖苷酶同源性最高,具有 60%的一致性和73%的相似性.该ORF在 E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似,酶谱分析表明该表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性,证实该基因为一个β-葡萄糖苷酶基因.测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G 的酶学特性,其最适 pH 和最适温度分别为 6.0～6.5 和 45℃.一些金属离子如 Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如 Fe3+、Cu2+能抑制 Umcel3G 的活性.在 pH4.5、35℃和 5 mmol/L 的 Ca2+存在的条件下,用 Ni-NTA 纯化的重组酶的比活为 22.8 IU/mg,说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值.     

碱性土壤微生物基因的克隆和多样性分析

从碱性土壤样品中直接抽提和分离宏基因组DNA, 首先构建了包含5 562个阳性克隆的碱性土壤16S rDNA文库, 随机抽取9个克隆测序后构建的系统进化树表明了碱性土壤环境微生物种群基因的多样性。纯化土壤宏基因组DNA后采用EcoRⅠ酶部分酶切处理, 我们又构建了以pGEM-3Zf(+)为载体的DNA部分文库AL01。AL01文库包含23650个克隆, 随机插入载体的外源DNA片段平均大小为3.2 kb左右, DNA文库的总容量为75.68 Mb。建库效率为从每克环境样品中获得6 000个左右的含随机外源DNA片段插入载体的克隆。采用酶活筛选策略, 我们从AL01文库中筛选到一个编号为pGXAA2011的阳性克隆携带有一个完整的碱性蛋白酶基因。蛋白酶活性检测其酶活作用最佳温度为40℃, 最适作用pH 值为9.5。另外, 我们还克隆和表达了一个新型b-葡萄糖苷酶基因unglu01, 该基因和现有数据库中的b-葡萄糖苷酶基因没有任何DNA或者氨基酸水平的同源性。将unglu01基因的ORF与表达载体pETBlue-2连接后导入宿主菌株Tuner(DE3)pLacI中, 该重组表达克隆在含柠檬酸高铁铵和七叶苷的LA平板上表现清晰的b-葡萄糖苷酶活性, SDS-PAGE电泳可以检测到29 kDa大小的目的蛋白。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的b-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库, 获得1.26×105个克隆, 文库含外源DNA的总长度 约为4.8×106 kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在pH5.0、37oC条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆, 序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF), 其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高, 具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似, 酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性, 证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性, 其最适pH和最适温度分别为6.0~6.5和45oC。一些金属离子如Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活, 而另外一些金属离子如Fe3+、Cu2+能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35oC和5 mmol/L的 Ca2+存在的条件下, 用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg, 说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的b-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库, 获得1.26×105个克隆, 文库含外源DNA的总长度 约为4.8×106 kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在pH5.0、37oC条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆, 序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF), 其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高, 具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似, 酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性, 证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性, 其最适pH和最适温度分别为6.0~6.5和45oC。一些金属离子如Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活, 而另外一些金属离子如Fe3+、Cu2+能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35oC和5 mmol/L的 Ca2+存在的条件下, 用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg, 说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。     

堆肥宏基因组柯斯质粒文库的构建和DNA提取技术的改进

堆肥环境中高浓度腐殖酸的存在阻碍了对这个环境中的未培养微生物的宏基因组研究。我们提出了一个确实可行的提取堆肥环境DNA的方法, 这个方法通过使用Sephadex G200＋酸洗PVPP层析柱与电洗脱两步纯化的方法成功地纯化堆肥环境来源的DNA, 用这个DNA成功构建了一个包含约10万个克隆的柯斯质粒文库。从这个文库中筛选到一个新的β-葡萄糖苷酶基因。针对文库低的阳性筛选率问题, 利用分子技术研究了不同的分离速度对提取到的总DNA中真核生物DNA量的影响, 以减少文库中真核生物DNA的污染。     

利用拓扑异构酶II提高转化效率及其在从细菌群落中克隆六六六γ异构体脱氯化氢酶基因中的应用

一个简单的技术上的调整被应用于利用T载体构建的基因组或宏基因组文库策略中。该技术利用拓扑异构酶Ⅱ将超螺旋引入松散的T-A环状重组分子,从而提高转化效率。利用该技术构建一个宏基因组文库,并从中克隆到一个六六六γ异构体脱氯化氢酶基因(linA-like)。     

温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其一个杀线虫蛋白酶基因的筛选

【目的】本研究旨在通过非培养手段构建和筛选宏基因组文库,以求找到新型的杀线虫蛋白酶基因。【方法】采用密度梯度离心法提取和纯化温室土壤微生物总DNA,经平末端、连接、包装、转染后,构建宏基因组Fosmid文库,同时,以脱脂奶为底物,以根结线虫为靶标,对文库进行功能初筛。【结果】该文库库容31008个克隆,平均插入片段36.5kb,包含1.13Gbp的微生物基因组信息,适合大规模的微生物功能基因筛选,通过功能初筛,筛选到1个含杀线虫蛋白酶基因的Fosmid克隆(pro12)。进一步构建和筛选出亚克隆(espro124a5),通过对基因结构进行了初步分析发现:espro124a5是一种分泌型胞外蛋白酶,与来自于Maricaulis maris MCS10(accession no.YP_756822at NCBI)的丝氨酸蛋白酶S15仅有45%的同源性,是一种新型的丝氨酸蛋白酶,有其保守的催化三元组:Asp469、His541和Ser348。【结论】密度梯度离心法提取到的DNA纯度高、片段长,完全能满足构建宏基因组Fosmid文库的要求;同时,构建的宏基因组Fosmid文库库容大,有利于我们从中筛选其他的微生物基因资源。     

一种来自于土壤宏基因组文库的AprN基因的鉴定

宏基因组文库技术的发展拓宽了酶学的研究范围,从而导致了一系列新型的生物催化剂被发现和鉴定。采用蛋白酶的活性筛选策略,从已构建的碱性污染土壤宏基因组文库分离得到了一个表达蛋白酶的阳性克隆。生物信息学分析表明该克隆所包含的外源DNA片断编码一个由381个氨基酸编码组成的多肽,该多肽大约为39kDa,等电点为8.91。BLAST软件分析该外源DNA片断包含一个完整的碱性蛋白酶基因（ap01）,GC含量为46.3%。相关酶学数据表明该阳性克隆所分泌的碱性蛋白酶最适作用pH值为9.5,最佳作用温度为40℃。     

海绵宏基因组文库构建及抗菌肽功能基因的初步筛选

宏基因组文库技术是利用未培养微生物基因资源的有效途径。成功构建澳大利亚厚皮海绵的Fosmid宏基因组文库,插入片段平均大小为36.8kb。利用建立的宏基因组文库,采用PCR技术初步筛选到具有编码抗菌肽的功能基因。这是我国首次尝试构建海绵宏基因组文库,对于今后开发利用海绵丰富的基因资源具有重要的意义。     

从植物共生菌宏基因组文库筛选新的生物催化酶基因

【目的】通过建立宏基因组文库的高通量保存与基于探针洗脱的多次膜杂交筛选方法,从植物共生菌宏基因组文库筛选具有生物催化潜力的新酶基因。【方法】首先根据滴度将初始文库噬菌体包装颗粒感染到EPI300-T1R E.coli,过夜培养后对应保存于96孔板;提取粘粒进行文库的杂交筛选。【结果】描述的洗脱条件可完全去除尼龙膜上与靶DNA结合的探针,并且尼龙膜上的靶DNA至少可用于7次探针杂交,从而明显提高宏基因组文库的筛选效率。【结论】以Enoate reductase(ER)和短链脱氢酶(SDR)的同源基因片段为探针,运用该方法经两轮筛选获得候选单克隆并进行了部分粘粒的测序,发现了新的ER和SDR同源基因,并克隆到相应的全长基因序列用于后续的表达与酶化学研究。     

雨生红球藻基因组文库的构建及鉴定

本研究以雨生红球藻34-1n为材料,提取其基因组DNA,利用限制性内切酶Sau3AⅠ对基因组DNA进行酶解,回收6~8kb的基因组DNA片段,并浓缩至200ng/μL。该片段与经BamH Ⅰ酶切和去磷酸化处理后的pUC18载体连接,然后电击转化到受体菌Escherichia.coli DH5α中,获得雨生红球藻34-1n的基因组文库。该文库的平均插入片段长度约为6.5kb,获得6×105个克隆数。通过PCR筛选,由雨生红球藻基因组文库中获得含bkt1序列的单克隆菌,与β-胡萝卜素氧化酶序列(GenBank:DQ086233.1)进行比对,结果表明bkt1基因组序列含有6个外显子。本研究为进一步鉴定雨生红球藻相关基因提供了一个文库平台。     

中华鳖孵化一周胚胎的肾脏/尿生殖嵴混合组织的cDNA文库构建与特征

为克隆到与胚胎发育有关的新基因,以孵化一周的中华鳖(Trionyxsinensis)胚胎的肾脏及尿生殖嵴混合组织为原始材料,采用SMART和长距离PCR技术,构建了一个中华鳖cDNA表达文库。分析结果表明,该未扩增的cDNA文库大约含有4.134×105个克隆。任意挑取了192个克隆,提取质粒后用SfiⅠ酶切鉴定表明没有插入片段的克隆为9个,插入了cDNA片段的克隆为183个,插入的cDNA片段大小范围为0.4-3.8kb。其中,插入片段在0.4-1.0kb之间的克隆为19个,在1.1-2.0kb之间的克隆为53个,在2.1-3.0kb之间的克隆为92个,大于3.1kb的克隆为19个。另外,任意挑选45个克隆,提取质粒后,从5′端进行测序,Blast分析表明,除了21个序列在GenBank中找不到同源序列外,其余24个序列在GenBank中均被证实有各自相应的同源序列,这些序列代表6种类型的基因核糖体蛋白基因、代谢酶基因、组织特异性表达的基因、转录因子基因、受体蛋白基因及其它基因。该发育阶段特异性cDNA文库可以进一步用于中华鳖胚胎发育过程中相关基因的鉴定分离、结构功能分析、以及表达调控机制等研究。     

葡枝根霉TP-02cDNA文库中两种新的β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

从具有良好降解纤维素能力的葡枝根霉TP-02的cDNA文库中筛选获得两个新的β-葡萄糖苷酶基因bgl1和bgl2,并在毕赤酵母中高效表达.阳性克隆在MM培养基中发酵84 h和1%的甲醇的诱导的情况下,产生的β-葡萄糖苷酶酶活达到峰值分别为8.2 IU/mL 和9.9 IU/mL,分别较原菌株葡枝根霉的β-葡萄糖苷酶酶活...     

漠黄梅共生菌藻宏基因组文库的构建

为了从耐旱地衣漠黄梅的共生菌藻基因组中筛选功能基因,并为蛋白质类药物的基因筛选提供平台,采用改进的CTAB方法提取其总DNA,用Sau3AⅠ限制性内切酶部分酶切基因组DNA,以质粒pUC19为载体,转入大肠杆菌DH5α中,构建了漠黄梅共生菌藻的宏基因组文库。该文库包含了4.8×105个重组子,插入片段的平均大小为4kb,覆盖漠黄梅菌藻的整个基因组4次。