微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅰ.高度立体选择性菌株的筛选

从361株细菌和酵母菌中分别筛选到12株可不对称水解布洛芬乙酯生成R(-)-布洛芬的细菌(5株菌对映体过量(ee)可达85%)和15株具有不对称水解布洛芬乙酯活性的酵母菌,其中皮状丝孢酵母T158生成S(+)-布洛芬,ee可超过92%.该酵母菌最适碳源为葡萄糖,浓度以1.0—1.5%适宜,蛋白胨浓度低于0.3%或高于0.5%对水解拆分均不利.酵母膏的加入显著提高水解活性,最适浓度0.3%.在培养基中添加表面活性剂吐温80(0.2%)既可提高拆分专一性,又能增强水解能力.     

微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅰ.高度立体选择性菌株的筛选

从361株细菌和酵母菌中分别筛选到12株可不对称水解布洛芬乙酯生成R(-)-布洛芬的细菌(5株菌对映体过量(ee)可达85%)和15株具有不对称水解布洛芬乙酯活性的酵母菌,其中皮状丝孢酵母T158生成S( )-布洛芬,ee可超过92%.该酵母菌最适碳源为葡萄糖,浓度以1.0—1.5%适宜,蛋白胨浓度低于0.3%或高于0.5%对水解拆分均不利.酵母膏的加入显著提高水解活性,最适浓度0.3%.在培养基中添加表面活性剂吐温80(0.2%)既可提高拆分专一性,又能增强水解能力.     

微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅱ.反应条件和产物提取

皮状丝孢酵母具有较强不对称水解底物专一性.在试验的五种布洛芬消旋酯中,水解甲酯和异丙酯生成s(+)-布洛芬ee可达97%,乙酯为93%以上;而水解活性以乙酯最强,转化率高于30%.不对称水解最适pH6.5—7.0;温度在28—37℃范围内拆分能力无明显差别.该酵母的水解酶为胞内酶,将酵母细胞制成两酮干粉进行水解可提高立体专一性.产物S(+)-布洛芬可借助于酸碱反应和有机溶剂提取得到,同时回收未水解的酯.     

微生物酶不对称水解合成S（＋）—布洛芬的研究：Ⅱ.反应条件和产物提取

皮状丝孢酵母具有较强不对称水解底物专一性。在试验的五种布洛芬消旋酯中,水解甲酯和异丙酯生成Ｓ（＋）－布洛芬ｅｅ可达９７％,乙酯为９３％以上;而水解活性以乙酯最强。转化率高于３０５。不对称水解最适ｐＨ６．５－７．０;温度在２８－３７℃范围内拆分能力无明显差别。该酵母的水解酶为胞内酶,将酵母细胞制成丙酮干粉进行水解可提高立体专一性。产物Ｓ（＋）－布洛芬可借助于酸碱反应和有机溶剂提取得到,同时回收未水解     

拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。     

离子束注入提高Trichosporon lactis T立体拆分布洛芬水平的研究

以从土壤中分离筛选到的可立体选择性水解布洛芬乙酯生成S-布洛芬的菌株Trichosporon lactisT为出发菌株,对其进行能量30KeV,剂量1×1015~5×1015ions/cm2的低能N 注入,筛选立体选择性水解布洛芬乙酯活性高的诱变株。菌株T.lactisT,在4×1015ions/cm2的诱变剂量下突变率最高,正向和负向突变率分别达32.9%和37.1%,因此选定该剂量为T.lactisT的最佳N 离子注入剂量。经离子束诱变,通过初筛和复筛,共筛选到7株水解布洛芬乙酯的高产菌株,其中诱变株K1培养24h时酶活力比出发菌株T高50%,且具有较好的遗传稳定性。将菌株K1和出发菌株T培养24h,分别加入布洛芬乙酯水解24h,二者水解布洛芬乙酯生成S-布洛芬旋光度均为 54.1°,对映体过量值ee%均为98%,K1菌株水解的产量达6.96g/L,而出发株仅为4.24g/L。     

离子束注入提高Trichosporon lactis T立体拆分布洛芬水平的研究

以从土壤中分离筛选到的可立体选择性水解布洛芬乙酯生成S布洛芬的菌株Trichosporon lactis Ｔ为出发菌株,对其进行能量30KeV,剂量1×1015～5×1015ions/cm2的低能N+注入,筛选立体选择性水解布洛芬乙酯活性高的诱变株。菌株T.lactis T,在4×1015 ions/cm2的诱变剂量下突变率最高,正向和负向突变率分别达32.9%和37.1%,因此选定该剂量为T. lactis T的最佳N+离子注入剂量。经离子束诱变,通过初筛和复筛,共筛选到7株水解布洛芬乙酯的高产菌株,其中诱变株K1培养24h时酶活力比出发菌株T高50%,且具有较好的遗传稳定性。将菌株K1和出发菌株T培养24h,分别加入布洛芬乙酯水解24h,二者水解布洛芬乙酯生成S布洛芬旋光度均为+54.1°,对映体过量值ee%均为98%,K1菌株水解的产量达6.96g/L,而出发株仅为4.24g/L。     

(S)-酮基布洛芬拆分用脂肪酶基因的克隆及表达

本实验室筛选出一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。通过构建其基因文库,从中筛选得到阳性克隆重组子pUC-NK1。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为633bp的脂肪酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该脂肪酶基因属首次发现(GenBank Accession No.EU381317),将此基因克隆到原核表达载体pET21b(+)中构建重组表达质粒pET-NKest1,转化Escherichia coli BL21,经Isopropyl-β-D-Thiogalactoside(IPTG)诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该脂肪酶成熟蛋白分子量约为20kDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯得到(S)-酮基布洛芬过量(e.e.%),由野生菌NK13的5.84%提高到75.28%,提高约15倍,说明该脂肪酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。     

酮基布洛芬拆分用酯酶产生菌的筛选及其催化特性

从土壤中筛选获得一株可以高对映选择性水解酮基布洛芬乙酯的酵母KET4,经鉴定为芸苔丝孢酵母（Trichosporon brassicae）。研究了该菌的生长和产酶过程,考察了其静息细胞对酮基布洛芬乙酯水解的催化特性。用该菌催化酯水解时,转化率为41%时,产物的对映体过量值为91%,对映选择率达到45。     

利用产脂肪酶B的毕赤酵母工程菌生物拆分制备西司他丁关键手性中间体的体系优化

S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸(S-(+)-DMCPA)是合成西司他丁的关键手性中间体。构建的毕赤酵母工程菌生产的脂肪酶可高选择性催化外消旋2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯(DMCPE)不对称水解制备S-(+)-DMCPA。对该工程菌产胞外脂肪酶的产酶条件及生物拆分反应条件进行优化,以提高其催化效率。优化获得重组毕赤酵母最佳产酶条件:采用BMMY培养基,培养基初始p H 8.0,500 m L摇瓶装50 m L培养基,每隔4 h向培养基中补加终体积分数为1%的甲醇。培养192 h后,发酵液中脂肪酶比酶活为4.41 U/L,较优化前提高了90.9%。利用含脂肪酶的发酵上清液进行DMCPE的生物拆分反应,底物浓度为15 mmol/L,30℃反应36 h,S-(+)-DMCPA的产率可达43.8%,e.e.值为99.8%。     

NK13中(S)- 酮基布洛芬拆分用酯酶基因的克隆及表达

以本实验室筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经初步鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),通过构建其基因文库,从中筛选得到一阳性克隆重组子pUC-NK。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为933bp的酯酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该酯酶基因属首次发现（GenBank登录号为DQ196347）,将此基因克隆到原核表达载体pET21b+中构建重组表达质粒pET-NKest,转化E.coli BL21,经IPTG诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为34KDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株的转化效率较原始菌有明显提高,由表达菌45min就能转化酮基布洛芬氯乙酯47.4％,而得到的(S)-酮基布洛芬过量（e.e.%）由野生菌NK13的5.84％提高到55.46％,提高将近10倍,说明该酯酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。     

拆分获得(R)-酮基布洛芬酯酶基因的筛选、克隆与表达

以自筛选出的具有一定不对称拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的野生菌Bacillus megaterium NK13为材料,通过构建其基因文库,筛选得到一个阳性克隆重组子pUC18-NK-HYD3。分析测序结果发现外源片段中包含一段完整的741 bp的开放阅读框,其编码的蛋白中含有酯酶的GXSXG保守序列。经在NCBI的BLAST系统中比对,证明该酯酶基因属于首次发现(GenBank Accession Number: GU143552)。将酯酶基因克隆到载体pET21b(+)中,转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后在宿主菌得到表达。SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为28 kDa。TLC和HPLC检测结果显示,该酯酶优先水解(R)-型底物,在重组菌菌液体系,转化率为15%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)最高,达62.74％;改用重组菌湿菌体的PBS体系后,在转化率为10%~50%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)一直保持在73%~76%之间。     

酮基布洛芬拆分用酯酶产生菌的筛选及其催化特性*

从土攘中筛选获得一株可以高对映选择性水解酮基布洛芬乙酯的酵母KET4,经鉴定为芸苔丝孢酵母（Trichosporon　brassicae）。研究了该菌的生长和产酶过程,考察了其静息细胞对酮基布洛芬乙酯水解的催化特性。用该菌催化酯水解时,转化率为41％时,产物的对映体过量值为91％,对映选择率达到45。     

产γ_内酰胺水解酶菌株的筛选及发酵条件研究

(-)γ-内酰胺是合成两种抗艾滋病药物(-)carbovir和(-)abacavir的重要原料,具有重要的应用价值,微生物酶法拆分( /-)γ-内酰胺生产(-)γ-内酰胺的方法具有良好的应用前景。以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源,从土壤中筛选得到了69株具有酰胺水解酶活性的菌株,利用液相色谱分析方法确定了其中20株有较高的酰胺水解酶活性,利用手性色谱分析的方法进一步得到了一株具有较高立体选择性,能拆分( /-)γ-内酰胺而获得(-)γ-内酰胺的菌株L29-9,对该菌株的产酶培养基的碳、氮源及初始pH值等进行了研究。结果表明:当选择碳源柠檬酸2g/L、氮源酵母提取物5g/Lp、H 7.0、培养时间40h时,通过完整细胞转化,在30℃下经过12h的反应,产物(-)γ-内酰胺产率达40%,ee值99.5%。     

一株不对称水解N-癸酰草铵膦生产L-草铵膦菌株的筛选及催化性质研究

从活性污泥样品中分离得到一株能不对称水解(D,L)-N-癸酰草铵膦的革兰氏阴性菌。经过16S r DNA测序分子生物学鉴定,命名该菌株为Pseudomonas sp. zjut126。当(D,L)-N-癸酰草铵膦浓度为8 g/L,湿菌体(含水75%):N-癸酰草铵膦=1∶1(w/w),反应24 h,产物L-草铵膦得率为16. 3%,eep 95%。该菌体催化的最适温度为30℃,在温度40℃以下催化稳定性较好。最适p H为7,pH在6～8之间催化稳定性较好。加入异丙醇有利于N-癸酰草铵膦的溶解,但对细胞催化活性有明显的抑制作用。建立了一条利用Pseudomonas sp. zjut126细胞作催化剂拆分(D,L)-N-癸酰草铵膦制备L-草铵膦的工艺路线,第一步先将(D,L)-草铵膦化学酰化得到(D,L)-N-癸酰草铵膦,然后用菌株选择性水解(D,L)-N-癸酰草铵膦生成L-草铵膦。将未反应的(D)-N-癸酰草铵膦与L-草铵膦进行分离,终产品L-草铵膦的含量是92. 0%,ee值为95. 2%。     

手性高效液相色谱法测定S(+)-布洛芬对映体过量

用手性固定相高效液相色谱法(CSP-HPLC)测定了样品或微生物酶不对称水解反应液中S(+)-布洛芬对映体过量(ee)。该法首先将布洛芬转化为二苯酰胺衍生物,然后在N-3,5-二硝基苯甲酰-?-苯甘氨酸[?-DNB-PG]的共价型CSP柱上进行对映体HPLC分离。流动相选择正已烷-异丙醇(98:2),流速1ml/min,对映体分离度1.47。按相同方法同时进行消旋布洛芬的二苯酰胺衍生物的分离,由其对映体峰高比可测定S(+)-布洛芬ee(%)。测定加量回收率相对标准偏差为3.3%。     

新颖深海微生物酯酶EstC11的酶学性质及其在手性拆分乙酸苏合香酯中的应用

【背景】手性乙酸苏合香酯是重要的手性香料产品,在食品及精细化工等领域都有重要的应用。酶催化不对称合成手性乙酸苏合香酯产品具有极好的工业应用前景。【目的】研究酯酶EstC11的基本酶学性质及其在制备手性乙酸苏合香酯中的应用。【方法】对来自西太平洋深海热液口芽孢杆菌Bacillus sp.CX01中的新颖微生物酯酶基因EstC11进行克隆、表达及酶学性质鉴定。通过对p H、温度、有机溶剂等反应条件的优化提高酯酶手性拆分乙酸苏合香酯的光学纯度。【结果】酯酶EstC11的最适反应p H为8.5,最适温度为25°C,一些金属离子和有机溶剂对酯酶EstC11的水解活性具有不同程度的抑制作用。通过对反应条件的优化,在最适反应条件下(p H 9.0 50 mmol/L Tris-HCl,20°C,50 mmol/L底物浓度)反应3 h后,(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度达98%,得率为39%。【结论】通过对酯酶拆分条件的优化,手性拆分乙酸苏合香酯生成(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度明显提高,为酯酶EstC11在工业化上的应用奠定了基础。     

不对称还原苯乙酮的酵母菌株筛选与分子鉴定

利用苯乙酮作为模式底物,对145株菌株进行初筛和复筛,获得一株具有高效立体选择性的酵母菌株YS6-2,能够不对称还原苯乙酮生成(S)-1-苯基乙醇.在苯乙酮浓度为70mmol/L时,底物的初始转化率达26.8%,产物(S)-1-苯基乙醇的对映体过量值为98.8%.基于形态学、生理生化特征、18S rDNA和26S rDNA D1/D2区域的分析表明,YS6-2为胶红酵母(Rhodotorula muci-laginosa).     

转化奎宁酮为(R)-3-奎宁醇菌株的筛选及转化条件优化

(R)-3-奎宁醇是一种用于合成各类药物的重要手性砌块,以奎宁酮盐酸盐为唯一碳源,筛选得到一株能够将奎宁酮不对称还原为(R)-3-奎宁醇的菌株X15。常规生理生化鉴定和18S rDNA序列分析表明,菌株X15属于粘红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa,定名为R.mucilaginosa X15。结果显示,菌株X15具有酮基还原能力和辅酶再生能力,在100 mL反应体系中可将奎宁酮还原为(R)-3-奎宁醇,转化率90%,ee值为88%。     

一种来源于毕赤酵母的高对映选择性羰基还原酶的性质及底物谱分析

手性醇是一类非常重要的化合物,羰基还原酶催化酮的不对称还原生成对应的手性醇.从毕赤酵母Pichia pastoris GS115基因组数据中找到一个潜在的NADPH依赖的羰基还原酶,研究毕赤酵母 P.pastoris GS115中的羰基还原酶.根据其核酸序列设计引物,从P.pastoris GS115基因组中扩增到目的基因ppcr,大肠杆菌BL21 (DE3)中表达,Ni-NTA纯化,对酶的性质和底物谱进行了研究.PPCR的最适反应温度为35℃,最适反应pH为6.0,低于45℃时有很好的稳定性.对3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km和kcat分别为9.48 mmol/L和0.12 s-1. PPCR表现出广泛的底物谱和很高的对映选择性,对醛、α-酮酯、芳香族β-酮酯及芳香族酮都表现出了很好的活性,在测定的底物中,除极少数底物外,ee值均达到97％以上.因此,PPCR具有较好的应用前景.