菊花5种病毒及类病毒多重RT-PCR检测方法的建立

菊花是世界最重要的园艺作物之一,兼具有茶用、药用、食用及观赏等多种经济价值。我国是栽培菊花的起源地,也是主要种植生产区。病毒病害是菊花生产过程中最主要病害,目前已知的菊花病毒及类病毒有20多种,对菊花产业危害巨大。建立快速、高效的检测方法是病害防控的必要条件。前期调查显示番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus,TAV）、菊花B病毒（Chrysanthemum virus B,CVB）、菊花矮化类病毒（Chrysanthemum stunt viroid,CSVd）和菊花褪绿斑驳类病毒（Chrysanthemum chlorotic mottle viroid,CChMVd）是北京地区菊花中主要病毒及类病毒种类。自NCBI数据库下载以上病毒/类病毒的基因序列,利用不同病毒保守区域,设计开发出特异性引物,建立了5种病毒/类病毒同时检测的多重RT-PCR体系;并对反应体系中引物对的含量配比、退火温度、模板含量等因子进行了优化。试验结果显示,TSWV、TAV、CVB、CChMVd、...     

十二种血清型蓝舌病病毒型特异性实时荧光定量RT-PCR定型方法的建立

为建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)十二种血清型(血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型)特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设计每种BTV血清型的扩增引物与TaqMan探针;以十二种血清型BTV参考毒株的cDNA为模板,进行引物的筛选,建立BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法;对检测方法的灵敏度、特异性与重复性进行验证,分别以含有50、100与200个BTV噬斑形成单位(Plaque forming unit,PFU)的模拟BTV阳性血液样本为检测对象,进行检测效果的评估.实验结果表明,建立的BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异性,对不同血清型BTV核酸拷贝数的检出下限在12拷贝/μL(BTV-8)至57拷贝/μL(BTV-14)之间;对我国反刍动物上广泛流行的流行性出血病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸的检测结果均为阴性.反应具有良好的重复性,组内Ct值的变异系数在0.92％至1.96％之间,组间Ct值的变异系数在0.26％至1.62％之间.对模拟BTV阳性血液样本的检测结果显示,BTV血清型特异性qRT-PCR可有效检测含50个PFU(噬斑形成单位)的BTV血液样本.本研究建立的十二种BTV血清型特异性qRT-PCR定型方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染BTV血清型的诊断.     

中国蓝舌病病毒流行株血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

[背景]蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,我国存在12种血清型BTV (BTV-l、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24)的流行.[目的]建立12种血清型BTV的RT-qPCR定型方法,为BTV的诊断与流行病学研究提供技术保障....     

实时荧光定量PCR及RT-PCR与常规PCR及RT-PCR检测对虾病毒效果的比较

常规PCR及RT-PCR已用于对虾DNA及RNA病毒检测,但存在费时、灵敏度较低、不能定量等问题。建立了TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR方法,分别用于检测白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)4种对虾病毒。与常规PCR及RT-PCR比较,所建立的TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR检测上述4种对虾病毒不仅有很高的特异性,检测灵敏度也提高了10～100倍,同时还具有快速、简便、不污染环境、重复性好、实时定量等优点,可明显提高对虾病毒检验检疫工作质量及效率。     

北美洲流行汉坦病毒多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立牛轭湖病毒(Bayou virus,BAYV)、纽约病毒(New York virus,NYV)、厄尼诺洛峡谷病毒(El Moro Canyon virus,ELMCV)以及岛景病毒(Isla Vista virus,ISLAV)四种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术,本研究选用上述四种病毒的N蛋白基因作为靶标区域设计四组特异性引物探针,建立四重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用四种病毒体外转录RNA进行灵敏度和重复性验证,并使用其他病毒细胞培养物及体外转录RNA进行特异性验证。结果显示,四重实时荧光定量PCR扩增效率均可达到95%以上,四种病毒体外转录RNA灵敏度介于1～10拷贝/μL,与单重检测方法无明显差异,且与其他病毒无交叉反应。稳定性评价结果显示,批内、批间变异系数均在3%以内。本研究所建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于相关样本的诊断与筛查。     

蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和评价

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃.本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法.参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计一组特异性引物和探针,并通过体外转录法制备RNA标准品作为阳性模板.在对反应体系进行优化的基础上,建立了 KBV的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样本验证.结果显示:该方法能有效扩增8×100拷贝/μL～8×107拷贝/μL 的KBV标准品,建立的标准曲线呈现良好的线性关系.该方法的检测灵敏度为8拷贝/μL,对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别低于1％和2％,重复性良好.应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法的特异性优于常规RT-PCR.本研究建立的实时荧光RT-PCR检测具有良好的敏感性、特异性和重复性,为KBV的检测和流行病学调查提供技术支持.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.方法 巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒.该质粒经限制性内切酶Not I酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品.结果 应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL.结论 制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.     

应用改良的实时TaqMan荧光定量 RT-PCR技术检测口蹄疫病毒及其3D基因转录水平

将改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术应用于口蹄疫病毒感染体内和体外的定量检测以及其3D基因转录水平分析.结果表明对样品中口蹄疫病毒基因组RNA的检测灵敏度可达l0个基因拷贝,可同时检测病毒正负链复制水平且重复性较好,所测口蹄疫病毒3D基因转录水平可高达6.9×104拷贝/μL;与实时SYBR GreenⅠ染料RT-PCR技术比较,改良的实时TagMan荧光定量RT-PCR技术检测灵敏度高6.7倍.以上结果证实,改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术在病毒检测和基因表达水平分析方面有更高的灵敏度和特异性.     

SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。     

TaqMan—MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。     

Micro-droplet Digital Polymerase Chain Reaction and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Technologies Provide Highly Sensitive and Accurate Detection of Zika Virus

The establishment of highly sensitive diagnostic methods is critical in the early diagnosis and control of Zika virus(ZIKV)and in preventing serious neurological complications of ZIKV infection. In this study, we established micro-droplet digital polymerase chain reaction(ddPCR) and real-time quantitative PCR(RT-qPCR) protocols for the detection of ZIKV based on the amplification of the NS5 gene. For the ZIKV standard plasmid, the RT-qPCR results showed that the cycle threshold(Ct) value was linear from 10~1 to 10~8 copy/l L, with a standard curve R~2 of 0.999 and amplification efficiency of 92.203%;however, a concentration as low as 1 copy/l L could not be detected. In comparison with RT-qPCR, the dd PCR method resulted in a linear range of 10~1–10~4 copy/l L and was able to detect concentrations as low as 1 copy/l L. Thus, for detecting ZIKV from clinical samples, RT-qPCR is a better choice for high-concentration samples(above 10~1 copy/l L),while ddPCR has excellent accuracy and sensitivity for low-concentration samples. These results indicate that the ddPCR method should be of considerable use in the early diagnosis, laboratory study, and monitoring of ZIKV.