四个脂肪酸合成酶基因在哺乳动物细胞中的超表达提高长链多不饱和脂肪酸生物合成效率

DHA(22:6n-3)、EPA(20:5n-3)和ARA(20:4n-6)三种长链多不饱和脂肪酸在生物体内活性最强,它们在促进大脑发育和功能维持以及在预防和治疗心血管疾病、炎症、癌症等多种疾病方面有着重要作用。然而,尽管哺乳动物体内有完整的长链多不饱和脂肪酸合成酶系,但哺乳动物合成这些长链多不饱和脂肪酸的效率很低而主要依赖于食物获取。本研究应用转基因方法,将哺乳动物来源的Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶这4种酶的编码基因构建成为一个多基因表达载体,然后转染哺乳动物细胞HEK293T,实现了4个目的基因的超表达,再通过气质联用(GC-MS)分析证实了DHA、EPA和ARA等长链多不饱和脂肪酸的合成效率及水平显著增加,DHA的水平更是提高了2.5倍。由此可见,哺乳动物具有某种抑制长链多不饱和脂肪酸高水平合成的机制,但通过Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶的超表达,能够打破哺乳动物这种抑制机制,从而显著提高DHA、EPA、ARA等的合成水平。同时,本研究的思路也为在转基因动物中生产长链多不饱和脂肪酸提供了重要的启示。     

脂酶催化的羧酸过氧化反应及其应用

脂酶除了催化经典的酯水解及酯化反应外,还能催化脂肪酸的过氧化。过氧脂肪酸也可以进行常规的Prileshajev环氧化。当不饱和脂肪酸参与反应时,就发生不饱和脂肪酸的自身环氧化而形成环氧脂肪酸。这个反应为脂酶的应用开辟了一个崭新的领域。     

脂肪酸脱饱和的应用进展

脂肪酸脱饱和是由脂肪酸脱饱和酶所催化的不饱和脂肪酸合成途径的关键步骤。脂肪酸脱饱和酶分为脂酰CoA脱饱和酶、脂酰ACP脱饱和酶和脂酰脂脱饱和酶等三类。近年来脂肪酸脱饱和遗传操作在植物抗寒育种、植物油基因工程、食品工程、微生物发酵工程和植物抗害育种等方面的应用研究均取得了相当进展。     

哺乳动物细胞多不饱和脂肪酸合成酶系的重建将亚油酸代谢转变为二十二碳六烯酸

二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3)是一种长度为22个碳原子且含有6个双键的ω-3系多不饱和脂肪酸,在人体中具有重要生物学功能。人体及其他哺乳动物体内只能合成少量的DHA,更多的需求必须从食物中获取。然而,DHA的天然资源(主要是深海鱼类等海洋产品)日趋枯竭,开发新型资源以满足不断扩大的市场需求势在必行。本研究利用转基因技术,在哺乳动物细胞中使Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶超表达,同时表达来源于秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的Δ15去饱和酶和小眼虫Euglena gracilis的Δ4去饱和酶,结果表明,这6种酶的表达或超表达能将ω-6系的亚油酸(LA,18:2n-6)有效地转化为DHA(22:6n-3),后者的含量从对照组的16.74%提高到实验组的25.3%。本研究的策略及技术路线为将来利用遗传改造的哺乳动物生产珍稀的DHA(22:6n-3)等长链多不饱和脂肪酸产品提供了重要的启示。     

鸭肝脂酸合成酶的NADPH底物抑制及作用动力学

已知动物脂肪酸合成酶的底物乙酰辅酶Ａ和丙二酰辅酶Ａ具有竞争性双底物抑制的乒乓机制。实验发现鸭肝脂肪酸合成酶的第三个底物ＮＡＤＰＨ也具有底物抑制,并研究了它的规律及与ＮＡＤＰＨ有关的稳态动力学。发现对于该酶的全反应,增加丙二酰辅酶Ａ浓度,降低环境盐浓度,均使ＮＡＤＰＨ底物抑制减少。但以ＮＡＤＰＨ作底物的酮酰还原和烯酰还原二步单独反应以及包含四步单独反应的乙酰乙酰辅酶Ａ还原反应都无ＮＡＤＰＨ底物抑制现     

脂肪酸合酶—特异性肿瘤治疗靶点

脂肪酸合成的产物———脂肪酸为肿瘤生长的物质和能量来源。脂肪酸合成的关键酶———脂肪酸合酶(fattyacidsynthase ,FAS)在肿瘤组织中高表达而在正常组织中含量较低 ,表明FAS可成为肿瘤治疗靶点。现就近年来有关FAS、FAS与肿瘤的关系以及FAS抑制剂等问题的研究进展进行综述。     

蓖麻和线虫的两种不同结构脂肪酸去饱和酶的原核表达

目的:通过在原核表达系统中表达蓖麻的可溶性脂肪酸去饱和酶基因和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶基因,为脂肪酸去饱和酶序列结构与功能的研究奠定基础。方法:将蓖麻RCD△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶基因亚克隆到大肠杆菌BL21表达载体pET32a+中,获得重组表达载体pET32a+-R9,pET32a+- F1,并通过SDS-PAGE和Western Blotting鉴定蛋白的表达情况。结果:经PCR和测序鉴定,证实两个重组质粒含有目的基因片段;SDS-PAGE和Western Blotting证实两种蛋白在大肠杆菌中获得表达,但表达量具有明显的不同;Anthepro软件对蛋白跨膜结构的分析,验证蓖麻△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶在结构上的不同。结论:蓖麻的RCD脂肪酸去饱和酶和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶都得到了表达,但线虫fat-1脂肪酸去饱和酶表达量偏低;这可能与fat-1脂肪酸去饱和酶是一类跨膜蛋白的性质直接相关。因此,对于线虫fat-1脂肪酸去饱和酶的基于蛋白纯化的结构分析有待进一步的研究。     

过氧化物酶体脂肪酸β氧化

除线粒体外,过氧化物酶体也是真核细胞脂肪酸β氧化分解的重要部位．过氧化物酶体β氧化过程包括氧化、加水、脱氢和硫解4步反应,主要参与极长链、支链脂肪酸等的分解．近年关于过氧化物酶体β氧化的研究活跃,在代谢途径及功能等方面有了新的认识,尤其在对相关代谢酶的研究中取得了较大进展．本文就过氧化物酶体β氧化相关进展作一综述．     

甘蓝型油菜Fad2与Fae1基因双干扰RNAi载体的构建

将来源于甘蓝型油菜XY15的Fad2与Fae1基因编码区,长度分别为349bp和426bp的两个保守序列片段连接成807bp的大片段。然后分别以正反向插入到pFGC5941干扰载体查耳酮合成酶内含子的两端,构建成RNAi载体。以期在菜籽中转录后能有效抑制Fad2与Fae1两个基因的表达。所构建的RNAi载体最终序列全长3kb,经限制性内切酶消化、PCR扩增验证和序列测定,证明目标序列与GenBank数据库中的碱基序列一致,并且为正反向插入到pFGC5941载体上。通过农杆菌介导的油菜转化,已获得油菜抗性再生植株144个。     

脂肪酸去饱和酶的研究进展

多不饱和脂肪酸由于其在生物体内具有重要的生物活性而越来越受到研究者的关注,特别是n-3系列的脂肪酸EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸）。脂肪酸去饱和酶在多不饱和脂肪酸的生物合成过程中起着重要的作用,本文对其目前研究进展进行了阐述。     

FAD2类酶在合成工业用脂肪酸中的应用

许多工业用稀有脂肪酸存在于非食用植物种子油中,它们由不同脂肪酸Δ12-去饱和酶（FAD2）催化,在油酸Δ12位引入环氧基、羟基、形成三键或共扼双键。目前已从不同生物中克隆得到一系列FAD2酶基因,并在油料植物中获得成功表达。但总体上看,目标脂肪酸累积量还相对较低,稀有脂肪酸生物合成及其从磷脂酰胆碱（PC）到储存甘油三酯(IAG)的转化机制尚需要进一步阐明。     

蔗糖脂肪酸酯对高压静电场与过氧化氢酶作用的影响

研究了蔗糖脂肪酸酯对高压静电场与过氧化氢酶作用的影响 ,结果表明 :在强度为 3× 10 3 v cm的电场作用下 ,蔗糖脂肪酸酯在 3.2mmol L的高浓度以上 ,可以保护过氧化氢酶不受高压静电场的影响。这可能是蔗糖脂肪酸酯使得溶液介电常数增大 ,使得作用在过氧化氢酶分子上的电场强度减小所致 ;在 1.4～ 1.6mmol L的浓度区间中 ,高压静电场使得过氧化氢酶的活力先增加后下降 ;在 0 .4～ 0 .7mmol L时 ,高压静电场使得过氧化氢酶的活力单调下降 ;在0 .0 0 8～ 0 .2 8mmol L的浓度范围内 ,高压静电场使过氧化氢酶的活力先下降后上升 ,可能使酶达到了一种新稳定态。蔗糖脂肪酸酯使得高压静电场对过氧化氢酶的作用变快 ,2～ 4min酶活力开始发生变化 ,而对照需要 2 0min以上。     

日本松干蚧不同虫态的泌蜡特点及FAS与FAE的含量变化

本文采用显微观察技术及酶含量测定方法,对日本松干蚧Matsucoccus matsumurae(Kuwana)分泌蜡质的几个虫态及各虫态虫体内与蜡质合成相关的脂肪酸合成酶(FAS)和脂肪酸延伸酶(FAE)的含量变化进行了研究。结果表明:雄性泌蜡主要在二龄若虫期和三龄若虫期,前者为珠形若虫,虫体分泌少量湿蜡,在体表形成薄蜡层,由气门周缘分泌蜡丝,后者泌蜡量大,为蜡丝结茧;雌性泌蜡主要在二龄若虫和雌成虫泌蜡形成卵囊期。FAS含量变化与泌蜡活动关系密切,在雄性的三龄若虫期最高,二龄若虫期次之,蛹期最低;雌性成虫泌蜡前和中期FAS含量最高,产卵完毕时最低,二龄若虫期居中;FAE含量与FAS变化相似,但在二龄若虫期也较高。这说明FAS和FAE参与了蜡质合成过程。     

黑鲷ELO基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析

黑鲷是一种抗逆性强的海水经济鱼类,但在长江以北无法在室外自然越冬,每年进行室内越冬又耗时耗力。为了培育黑鲷耐低温品系,探究黑鲷低温耐受的分子机制,研究了黑鲷脂肪酸延长酶（fatty acid elongase,ELO）基因编码蛋白的结构和功能。首先,运用DNAman 8软件对黑鲷、金头鲷、鱖鱼、斜带石斑鱼、鲤鱼等5种鱼类的ELO蛋白进行氨基酸序列比对,分析其同源性和进化关系;随后,利用生物信息学工具对黑鲷ELO蛋白的理化性质、亚细胞定位、信号肽、跨膜区、剪切位点、蛋白磷酸化、糖基化、二级结构、结构域、分子功能及蛋白质相互作用等进行分析,并进行同源建模与三维结构预测。氨基酸序列比对结果显示,黑鲷与其他鱼类之间序列的同源性较高,在所分析的5种鱼类中,黑鲷与金头鲷亲缘关系最近,与鲤科鱼类亲缘关系最远。生物信息学分析结果表明,ELO蛋白为碱性、小分子、稳定、非分泌型亲水蛋白质,亚细胞定位于细胞质、细胞核和线粒体;该蛋白质中存在22个剪切位点、19个磷酸化位点和 9个赖氨酸糖化作用位点,没有糖基化位点和信号肽;其包含多种二级结构,其中以α-螺旋为主,存在1个结构域及7个跨膜区域;ELO蛋白与其他10个蛋白质可能存在直接的相互作用关系,有可能影响雌激素合成。通过对黑鲷ELO基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析,初步判定其与低温耐受相关。研究结果为黑鲷耐低温品系选育提供了基础理论依据。     

△12-脂肪酸去饱和酶FAD2的基本特性及其在胁迫中的功能

脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)催化与载体结合的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸在脂酰链上形成双键.脂肪酸去饱和酶可以分为脂酰ACP去饱和酶、脂酰CoA去饱和酶和脂酰脂去饱和酶三类.而脂酰脂去饱和酶中的△12-脂肪酸去饱和酶(△12 fatty acid desaturase,FAD2)是催化脂肪酸链第12位碳原子形成双键的去饱和酶类,控制着油酸、亚油酸和其他多种不饱和脂肪酸的合成和含量.主要从△12-脂肪酸去饱和酶FAD2的基本特性和在胁迫中的功能进行了综述,并对相关研究领域的未来研究方向进行了展望.     

来源于线虫Caenorhabditis briggssae 的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。     

DHA合成途径中关键酶基因在毕赤酵母中的表达研究

DHA（二十二碳六烯酸）是人体所需的一种非常重要的多不饱和脂肪酸,主要存在于深海鱼类和海洋微藻类生物中。由于高等植物自身不能合成DHA,因此通过基因工程方法在作物(如玉米)中表达DHA,将会成为最健康的DHA来源,同时也能够减轻人类对海洋资源的破坏。从深海藻类中挑选了5个DHA合成途径中的关键酶基因,分别是Δ4脱饱和酶基因（D4）、Δ5脱饱和酶基因（D5）、Δ6脱饱和酶基因（D6）、C18延长酶基因（E18）和C20延长酶基因（E20）。密码子优化并合成这5个基因,为确定优化后的核苷酸序列是否能在真核生物中正确表达,以pPIC9K为基础载体连入目的基因转化到毕赤酵母GS115 (His4+MUts)中进行表达分析。结果表明,这些基因在甲醇诱导96 h后蛋白表达量最大,Western Blot结果表明表达产物为目的蛋白。该结果为进一步培育能够自身合成DHA的作物奠定了基础。     

“自我剪切”2A肽介导的Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶以及过氧化氢酶在转基因小鼠肌肉表达研究

哺乳动物因为缺乏Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶,不能自身合成必需的多不饱和脂肪酸．目前,通过转基因技术在哺乳动物体内表达ω-3脂肪酸脱氢酶,能将长链的n-6多不饱和脂肪酸转化成n-3多不饱和脂肪酸,造成体内长链的n-6多不饱和脂肪酸含量显著减低．本研究通过自我剪切2A肽介导Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶(FAT-2和FAT-1)以及人过氧化氢酶(human catalase,hCAT)在小鼠的肌肉同时表达．结果表明,转基因小鼠肌肉中长链n-3多不饱和脂肪酸含量提高2.6倍,长链n-6多不饱和脂肪酸含量没有显著变化,而n-6/n-3比例显著降低(P < 0.01)．同时蛋白质印迹检测到人过氧化氢酶hCAT在小鼠的肌肉组织中表达,且过氧化氢酶活性比野生型小鼠显著提高(P < 0.01)．     

肌肉脂肪酸转运膜蛋白及其相互关系

肌肉（骨骼肌）组织对脂肪酸的利用水平是影响机体能量稳态的关键因素.肌肉摄取的长链脂肪酸(long chain fatty acids,LCFAs)主要依赖细胞膜载体蛋白协助的跨膜转运过程.近年来,一系列与脂肪酸转运相关的膜蛋白被相继克隆鉴定,其中在肌肉中大量表达的有脂肪酸转运蛋白-1（fatty acid transport protein-1,FATP-1）、膜脂肪酸结合蛋白（plasma membrane fatty acid binding protein,FABPpm）、脂肪酸转位酶（fatty acid translocase,FAT/CD36）和小窝蛋白-1（caveolin-1）.研究上述肌肉脂肪酸转运膜蛋白的结构功能、调控机制及相互关系,可能为肥胖等脂类代谢紊乱疾病的诊治提供新的手段.