金钱鱼Sox9 cDNA克隆及其表达分析

为了解Sox9基因在金钱鱼(Scatophagus argus)性腺分化中的作用,本研究利用c DNA末端快速扩增法(RACE)克隆了金钱鱼Sox9基因c DNA全长序列,同时研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)(50 mg/kg)后该基因的表达及其性腺的组织学变化。金钱鱼Sox9 c DNA全长2 759 bp,包括5′非翻译区(5′-UTR)31 bp、3′非翻译区(3′-UTR)1 288 bp和开放阅读框(ORF)1 440 bp,编码479个氨基酸。该氨基酸序列104~172位为HMG保守盒,在该盒内存在一个特征性基序,两个核定位信号NLS及一个富含亮氨酸的核输出信号NES。该序列与赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的相似性最高,为96.0%,与非洲爪蟾(Xenopus laevis)、人(Homo sapiens)、原鸡(Gallus gallus)、小家鼠(Mus musculus)等物种的相似性为61.5%~76.1%。Real-time PCR显示,金钱鱼Sox9基因在脑、鳍、精巢中表达量较高。组织学研究表明,芳香化酶抑制剂来曲唑能有效诱导金钱鱼发生不同程度的性逆转,性腺中卵母细胞退化,精原细胞增殖。Real-time PCR结果显示,金钱鱼Sox9基因在来曲唑处理20 d后开始不断上升,于处理后第40天时达到最高值,在第60天时表达量迅速下降。上述结果表明,金钱鱼Sox9基因高度保守,可能在金钱鱼性腺雄性化过程中起重要作用。     

大头蛙Sox基因的克隆与序列分析

参考人SRY基因HMC—box的保守区序列,设计一对特异引物,采用PCR技术扩增了大头蛙的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆与测序。结果在雌雄个体中均扩增出217bp的基因片段,与人对照相同。序列分析表明,大头蛙雌雄个体之间Sox序列没有差异,与人SOX基因的同源性达到88％,与其它各类动物的Sox基因也都有非常高的相似性。结果支持Sox基因在进化上十分保守的结论。     

鲤鱼中Sox9b基因的克隆和表达

Sox9基因是一个重要的转录调控因子,参与性别决定及软骨等多种组织和器官的发育过程。本研究利用简并引物扩增鲤鱼基因组DNA,首次发现在鲤鱼中存在两种形式的Sox9基因。二者在保守盒区编码的氨基酸序列相同,并都存在一个内含子,但内含子序列差异很大,分别长704bp和616bp。在此基础上采用RACE技术克隆了鲤鱼Sox9b基因的5’端和3’端,通过拼接获得了2447bp的全长cDNA序列。编码428个氨基酸。其中96—174位共79个氨基酸为HMG保守盒。将鲤鱼Sox9b基因与三刺鱼等九种动物的氨基酸序列相比较发现。它们的同源性高达75％以上,显示soz9基因在进化中较保守。应用半定量RT—PCR技术对成体鲤鱼不同组织中Sox9b基因的表达进行了分析。结果表明该基因广泛表达,尤以脑及精巢中表达最为丰富。     

乌龟Sox基因的克隆及测序

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列,设计1对兼并引物,扩增了乌龟（Chinemys reevesii)的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序,结果在雌雄个体中均筛选出4个不同的Sox基因,无性别差异性;其DNA序列和编码的氨基酸序列与人相应的SOX基因的相似性分别为92%、91%、84%、92%和100%、93%、98%、98%,显示出高度的保守性。     

扬子鳄4个Sox基因保守区的克隆及序列分析

参考人SRY基因HMG－box的保守区序列,设计一对简并引物,用PCR扩增了扬子鳄Sox基因的HMG－box,并对PCR产物进行了亚克隆和测序。结果在雌雄个体中均筛选到4个不同的Sox基因,无性别差异。其序列与人相应的SOX基因保守区编码序列的相似性分别为91％、96％、100％、96％,分别命名为AS－Sox1,ASSox2,ASSox11,ASSox22。与其他动物相关的Sox/SOX基因的聚类分析结果表明,扬子鳄Sox基因编码的氨基酸序列与进化位置各异的其他动物的Sox/SOX基因编码的氨基酸序列存在高度的同源性,显示出Sox基因在系统进化上的高度保守性。     

赤链蛇Sox基因的克隆及序列分析

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列,设计一对兼并引物,采用PCR技术扩增了赤链蛇的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序,结果在雌雄个体中共筛选出三个Sox基因,其中有一个为雌雄共有,显示出性别差异性;三个Sox基因编码的氨基酸序列与人相应SOX3,SOX4,SOX22基因的相似性分别为96%,98%,96%。显示出Sox基因在进化上的高度保守性,本文为赤链蛇的性别决定机制研究提供了分子资料。     

平胸龟Sox基因的克隆和序列分析

本文采用ＰＣＲ技术扩增和克隆了平胸龟的Ｓｏｘ基因,并通过银染测序进行了序列分析。结果显示,平胸龟雌雄个体均能扩增出相同长度的片段,其ＤＮＡ序列与人ＳＲＹ基因的ＨＭＧ－ｂｏｘ同源性达７２．７％,推测的氨基酸序列与ＳＲＹ基因的ＨＭＧ－ｂｏｘ序列同源性为４６．５％,充分显示出Ｓｏｘ基因在系统进化上的保守性。本文为Ｓｏｘ基因的起源和进化研究提供了资料。     

虎纹蛙四个Sox基因的克隆及序列分析

参照人SRY基因HMG－box保守区的序列,设计一对兼并引物,扩增了虎纹蛙的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果在雌雄个体中共筛选出四个不同的Sox基因,其序列与人相应SOX基因的相似性分别为92％、94％、985和98％。本研究为探索虎纹蛙的性别决定机制提供了分子资料。     

人ZP3基因的RT-PCR cDNA克隆

目的：研究人ZP3基因的结构及构建人ZP3基因原核表达系统。方法：从人卵巢组织中分离出mRNA并以此作为模版,通过RT—PCR扩增出人ZP3基因cDNA片段,然后将其克隆在pUC18质粒上,并对克隆片段进行序列分析。结果：共克隆到ZP3-A（1300bp）、ZP3-B（1180bp）、ZP3-C（1200bp）和ZP3-D（1080bp）4种不同长度的人ZP3基因cDNA片段,对其中最长的ZP3-A片段的测序结果表明,它包含了人ZP3基因阅读框内的全部序列,与NCBI Sequence Viewer中公布的人ZP3 mRNA序列（NM-007155）相比较,在1275bp长的编码区内只有一个碱基不同,两者同源性达到99．92％。结论：本研究克隆到的ZP3-A cDNA片段确是人ZP3基因无疑。     

小鼠Sry基因和Sox基因的克隆分离与鉴定

为了深入探讨性分化分子机制,构建了小鼠基因库以ＳＲＹ探针筛选,分离到了两组阳性克隆,一组含ＥｃｏＲⅠ／３．５ｋｂ,此片段中载有小鼠Ｙ染色体上的Ｓｒｙ基因,另一组含ＥｃｏＲⅠ／３．０ｋｂ或ＳａｌⅠ／３．０ｋｂ,此片段有小鼠Ｙ染色体之外的Ｓｏｘ基因。     

羊驼催乳素基因cDNA克隆及序列分析

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示。从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断。测序后在NCB I工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。。     

大鼠脑谷氨酸脱羧酶基因的cDNA克隆及序列分析

胰岛β－细胞自身抗原蛋白之一是脑中谷氨酸脱羧酶（Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ,ＧＡＤ,ＥＣ４．１．１．１５）同源物,以双链ｃＤＮＡ为模权,用ＰＣＲ方法快速克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑ＧＡＤ基因的ｃＤＮＡ将此包括编码５９３个氨基酸的全长ＤＮＡ片段重组入ｐＵＣ质粒并用双脱的氧末端终止法测定了全部序列,证明其全长为１７７９ｂｐ,经比较发现Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑与Ｒｕｓｓｅｌｌ报导的大鼠脑Ｇ     

金钱鱼毒腺cDNA表达文库的构建及EST序列分析

以金钱鱼 (Scatophagusargus)毒腺为出发材料 ,构建以真核表达载体pcDNA3 0为基础的金钱鱼毒腺cDNA表达文库 .应用SMARTTM cDNALibraryConstruction技术和生物信息学分析等方法 ,通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析 ,获得了 2 0 1个金钱鱼新表达序列标签 (ESTs) ,其中已确定全长cDNA的克隆有 2 7个 ,包括多个核糖体大小亚基蛋白 (ribosomalprotein)、细胞凋亡相关蛋白 (programmedcelldeath 10 ) ,G蛋白信号调控子 (Gproteinsignalingregulator)、胸腺素(thymosinbeta 4 )、延伸因子 (translationelongationfactor 1 alpha)和泛素 (ubiquitin)等 .金钱鱼毒腺cDNA表达文库的成功构建 ,为研究金钱鱼毒腺的活性组分及其作用机制奠定了基础 ,也是分离新基因不可多得的重要资源     

北极狐GHR基因cDNA的克隆及序列分析

本文根据狗(AF133835)的GHR基因cDNA编码全序列设计了三对引物,利用RT-PCR方法克隆出北极狐GHR基因编码区全长cDNA序列(GenBank accession No.EU304325)。结果表明,北极狐GHR的ORF为1917bp,编码638个氨基酸的前体蛋白,由18个氨基酸的信号肽和620个氨基酸的成熟肽组成。通过同源性比较发现北极狐与狗的同源性最高,达到98%。另外,利用邻接法(NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,北极狐与狗先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。另外,通过氨基酸对位序列比较发现,北极狐GHR在氨基酸序列上存在明显的特异性,如45和451位分别为A和E,而其它物种均分别为T(大鼠为K)和A(牛羊为V,鼠为T)。     

cDNA RDA法克隆小鼠鼻咽部组织特异性表达基因

采用ｃＤＮＡ代表性差异分析法（ｃＤＮＡ ＲＤＡ）克隆小鼠鼻咽部组织特异性表达基因。通过三轮消减杂交后,获得了七个差异片段。随机选择两个差异片段ＴＤＰ１和ＴＤＰ４,经ＤＮＡ印迹和ＲＮＡ印迹证实了ＴＤＰ１在鼻咽部特异性表达,而ＴＤＰ４在鼻咽部及食道均有表达,并没有特异性。进一步对这两片段测序分析,并与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ等数据库同源比较,推测ＴＤＰ１和ＴＤＰ４是两个新的基因片段,但是仅ＴＤＰ１在小鼠鼻咽部     

三倍体湘云鲫3个Sox基因保守区的序列分析

SOX/Sox基因家族成员的主要特征是具有一个HMG(high mobility group)保守盒,其编码的蛋白质可以和DNA序列特异性结合,是一类重要的转录调控因子1,在个体发育过程中SOX/Sox基因对性别分化和组织器官形成起着重要作用。SOX/Sox基因的研究不仅可以揭示性别分化和胚胎发育的机制,而且可为某些遗传疾病的诊断和治疗提供分子方面的资料,因而有着非常重要的理论和应用价值。       

Sox1基因在爪蟾早期发育中的时空表达图式

克隆了非洲爪蟾的Sox1基因并研究了它在非洲爪蟾早期发育过程中的时空表达图式,比较了Sox1—3基因在发育的脑和眼中的表达图式。序列比对分析显示Sox1—3蛋白在其HMG框结构域具有高度的保守性。通过RT-PCR方法分析了Sox1基因在爪蟾早期不同发育时段的表达情况,结果显示Sox1基因从未受精卵到尾芽期均有表达,但表达强度有所差异。原位杂交结果显示,在早期卵裂阶段和囊胚期,Sox1基因主要在动物极表达;从神经板期开始,Sox1基因主要在中枢神经系统和眼原基中表达。在蝌蚪期,Sox1与Sox2、Sox3在脑部和眼睛的表达区域有所不同。对于爪蟾Sox1基因时空表达图式的研究将有助于阐明SoxB1基因家族在脊椎动物神经系统发生过程中的作用。     

中华绒螯蟹两个Sox基因HMG－box的克隆及测序

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列设计一对兼并引物,PCR扩增中华绒螯蟹的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果表明：在雌雄性个体中筛选出两个不同的Sox基因ESSox3和ESSox22,尽管中华绒螯蟹属甲壳类动物,但所测序列ESSox3和ESSox22的DNA序列和编码的氨基酸序列与人相应SOX基因的相似性分别为84%,85%和97%,81%,表明该基因在进化上具高度的保守性。本研究为探索中华绒螯蟹的性别决定机制以及Sox基因的进化提供了分子资料。     

赤链蛇不同组织Sox基因表达的RT-PCR分析

采用RT-PCR技术,研究了赤链蛇不同组织Sox基因的表达。通过PCR产物直接克隆法和SSCP技术筛选阳性克隆,分析了雄性睾丸和雌性卵巢组织中的Sox基因序列。结果显示,在赤链蛇雌雄成体组织中,Sox基因在睾丸、卵巢、脑和脾组织中均有不同程度的表达,而在雌雄成体肌肉组织中均无表达,显示该基因表达有一定的组织特异性。序列分析显示睾丸组织中表达的是DRSox3,卵巢组织中表达的是DRSox22。在Sox家族中,Sox3表达于中枢神经系统和尿生殖嵴的发育过程中;Sox22则表达于多种组织和神经系统中,可横跨CNS和PNS的整个过程。此结果表明Sox基因不仅在性别决定中起作用,还可能在胚胎发育过程中担负重要功能。     

鲤鱼中Sox9b基因的克隆和表达

Sox9基因是一个重要的转录调控因子,参与性别决定及软骨等多种组织和器官的发育过程。本研究利用简并引物扩增鲤鱼基因组DNA,首次发现在鲤鱼中存在两种形式的Sox9基因。二者在保守盒区编码的氨基酸序列相同,并都存在一个内含子,但内含子序列差异很大,分别长704bp和616bp。在此基础上采用RACE技术克隆了鲤鱼Sox9b基因的5’端和3’端,通过拼接获得了2447bp 的全长cDNA序列,编码428个氨基酸。其中96-174位共79个氨基酸为HMG保守盒。将鲤鱼Sox9b基因与三刺鱼等九种动物的氨基酸序列相比较发现,它们的同源性高达75%以上,显示Sox9 基因在进化中较保守。应用半定量RT-PCR技术对成体鲤鱼不同组织中Sox9b基因的表达进行了分析,结果表明该基因广泛表达,尤以脑及精巢中表达最为丰富。