利用Inverse PCR快速筛选单个T—DNA拷贝转基因水稻植株的方法

In order to obtain single T-DNA copy transgenic rice, we have established a quick method to estimate the T-DNA copy number in transgenic rice using inverse PCR (IPCR). IPCR was used to amplify junction fragments, i.e. plant genomic DNA sequences flanking the known T-DNA sequences, which will help to estimate the T-DNA copy number in transgenic rice. We have analyzed 20 transgenic plants of 15 transgenic lines. Most plants (12) contain one integrated T-DNA copy per genome, 3 plants contain two and 1 plant contains 3 copies. In 4 transgenic plants no T-DNA copies could be detected using this method. The IPCR results were further tested by Southern analysis and sequence analysis.     

水稻OsCatB敲除突变体的构建及耐逆性初步分析

水稻过氧化氢酶B (catalase B, CatB)主要在非光合组织、愈伤组织、根和种子中表达,参与调控活性氧动态水平的平衡和根系的生长。目前, CatB参与非生物胁迫响应的功能在很大程度上是未知的。本研究利用基因编辑技术CRISPR/Cas9获得OsCatB基因敲除的纯合突变体catb,并分析了catb在盐、高温和氧化等胁迫处理下的生理和生化表型。研究结果发现,在盐处理下,突变体catb的生理和生化表型与野生型植株无显著差异;在热胁迫下, catb的过氧化氢酶活性和存活率与野生型植株相比显著降低,而H2O2含量显著升高;在氧化胁迫下, catb的幼苗高度低于野生型。这些结果说明,水稻CatB参与盐胁迫响应的调控不明显,而主要参与了高温和氧化胁迫响应,并正调控水稻的高温和氧化胁迫耐受性。该研究为进一步探究Os CatB参与逆境响应的分子机制和培育抗逆水稻品种提供了一定的理论指导和遗传材料。     

三唑酮提高水稻幼苗抗旱性的研究

在-0.5MPa渗透胁迫下三唑酮提高水稻(Oryza sativa L.)幼苗相对含水量,降低丙二醛(MDA)含量,提高了抗旱性。三唑酮(75mg/L)可提高渗透胁迫下水稻幼苗过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,对超氧物歧化酶(SOD)活性影响不大。加入蛋白质合成抑制剂环己亚胺试验证明,三唑酮对POD的效应是促进酶蛋白的合成。     

镍处理对水稻叶片H202积累和抗病的诱导效应

2.20mmol/L的硝酸镍处理水稻幼苗后第3天用稻白叶枯(Xanthimonasoryzaepv.oryzae)挑战接种,硝酸镍处理的稻苗病情比对照明显减轻,并且叶片中过氧化物酶(POD)活性上升,过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性明显下降,H     

不同耐旱性水稻幼苗对氧化胁迫的反应

干旱条件下水稻(Oryza sativa L.)耐旱性较强的“湘中籼2号”比耐旱性较弱的“湘早釉12号”O_2~-的产生速率低。百草枯(0.01mmol/L)和H_2O_2(10mmol/L)处理促进干旱对水稻幼苗的伤害,但耐旱性较强的品种伤害较轻。单独用百草枯处理后,耐旱性较强的品种比耐旱性较弱的品种能更大幅度地提高超氧物歧化酶和过氧化物酶的活性;而H_2O_2处理后耐旱性较强的品种能提高过氧化氢酶活性。这些结果表明,耐旱性较强的水稻品种有较强的抗氧化胁迫能力。     

小麦中T—2毒素的污染调查

采用酶联免疫吸附测定法(ELlSA),调查了我国部分地区1990年国产小麦T—2毒素的污染状况。调查结果表明,在330份样品中,有264份检出T—2毒素,占样品总数的80％。样品中毒素含量最高达1122．Oppb,平均含量为53．3ppb。在引起食物中毒的48份小麦样品中,检出高含量的T—2毒素(84．5—1064．4Ppb)。我国小麦中T—2毒素的污染水平与小麦赤霉病的流行密切相关。     

创伤后抑制性T细胞对活化T细胞内白介素2及白介素2受体α基因表达的影响

研究了创伤小鼠抑制性T细胞(Ts)对白介素2(IL-2)及IL-2受体(IL-2R)α基因表达的抑制作用。结果表明,创伤后Ts细胞对正常活化T细胞内IL-2 mRNA及IL-2 RαmRNA水平的抑制作用增强,以伤后4天最为明显,伤后10天仍未恢复正常。创伤后Ts细胞还可升高正常活化T细胞内cAMP含量,降低cGMP含量,增加cAMP/cGMP比值。且可降低三磷酸肌醇(IP_3)含量、游离钙(Ca~(2 ))浓度、钙调素(CaM)、钙调素依赖性蛋白激酶(CaM-PK)及蛋白激酶C(PKC)的活性。去除创伤小鼠活化T细胞中的Ts细胞,则可使其IL-2mRNA及IL-2RαmRNA水平明显升高。并可使cAMP、cGMP、IP_3含量、Ca~(2 )浓度、CaM、CaM-PK及PKC活性的变化发生逆转。表明创伤后Ts细胞可通过影响T细胞内环核苷酸含量及磷脂酰肌醇代谢途径,进而抑制IL-2及IL-2 Rα的基因表达。     

水稻披垂叶突变体及其杂交后代的耐旱性与保护酶活性分析

在水分胁迫条件下时两个粳型水稻披垂叶突变体品系及其与常规籼、粳品种的杂交后代（F1、F2）进行苗期耐旱性鉴定,并测定了旱种条件下突变体及其杂交后代不同生育期过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性的变化以及相关农艺性状的特征。结果表明：两个水稻披垂叶突变体MR304和MR312的苗期耐旱性均为中抗;MR312与7个品种的11个杂交后代（F1）中,仅有文稻2号／MR312组合的苗期耐旱性为高抗,MR312／滇香籼1号为中抗;在昆明旱种条件下,突变体及其杂交后代POD和CAT的活性分别在孕穗期和抽穗期最高,其中4个组合（银光／MR312、农安稻／MR312、文稻2号／MR312和MR312／滇香籼1号）F1孕穗期POD或抽穗期CAT的活性最强,株高、分蘖、穗长趋于正常。该研究揭示了利用水稻披垂叶突变体产生的F1杂种优势可增强杂交稻大田期的耐旱性;孕穗期的POD活性和抽穗期的CAT活性是鉴定杂交后代F1和F1植株大田期耐旱性的重要指标。     

创伤后巨噬细胞对T细胞白介素2及白介素2受体α基因表达的直…

以２５μｇ／ｍｌ的丝裂霉素Ｃ处理巨噬细胞３０ｍｉｎ,可阻断巨噬细胞白介素１（ＩＬ－１）、白介素６（ＩＬ－６）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）及前列腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）的合成与分泌。创伤小鼠巨噬细胞经丝裂霉素Ｃ处理后,可明显抑制正常Ｔ细胞白介素２（ＩＬ－２）ｍＲＮＡ及ＩＬ－２受体（ＩＬ－２Ｒ）α ｍＲＮＡ水平,并增强Ｔｓ细胞的抑制活性。去除Ｔ细胞中Ｔｓ细胞可使巨噬细胞的抑制作用消失。表明创伤后巨噬细胞可通过     

镍处理对水稻叶片H2O2积累和抗病的诱导效应

2.20mmol/L的硝酸镍处理水稻幼苗后第3天用稻白叶枯菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）挑战接种,硝酸镍处理的稻苗病情比对照明显减轻,并且叶片中过氧化物酶（POD）活性上升,过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性明显下降,H2O2和丙二醛（MDA）含量显著增加。这些结果表明,H2O2积累与镍诱导的抗病作用密切有关。     

过表达OsCatC基因水稻的获得及其耐盐性机理分析

过氧化氢酶C (Catalase C,CatC)作为重要的抗氧化酶,在水稻发育和胁迫响应方面起重要作用。为了探究CatC在盐胁迫响应中的功能及其作用机制,该研究构建了OsCatC过表达转基因水稻,并比较了其耐盐性和相关抗逆生理指标的变化。结果表明:(1)成功构建过量表达载体pCUbi1390-OsCatC-Flag,并经农杆菌介导的愈伤组织转化获得了30个独立转基因株系(T₀),Western blot鉴定T₁代幼苗共获得2个OsCatC过表达株系(OE-10、OE-18);qRT-PCR分析发现,OE-10和OE-18株系的OsCatC转录水平显著高于野生型(WT),证明OsCatC基因已成功过表达于转基因株系(OE-10、OE-18)中,且能正常翻译为融合蛋白CatC-Flag。(2)正常水培条件下,OE-10和OE-18与WT的水稻幼苗长势无明显差异,200 mmol·L^-1 NaCl处理7 d后再恢复水培10 d时,OE-10和OE-18幼苗的存活率为20%～25%,而WT幼苗绝大部分则干枯死亡,存活率仅为5%左...     

镍处理对水稻叶片H_2O_2 积累和抗病的诱导效应

2 .2 0mmol/L的硝酸镍处理水稻幼苗后第 3天用稻白叶枯菌 (Xanthomonasoryzaepv .oryzae)挑战接种 ,硝酸镍处理的稻苗病情比对照明显减轻 ,并且叶片中过氧化物酶 (POD)活性上升 ,过氧化氢酶 (CAT)和抗坏血酸过氧化物酶 (APX)活性明显下降 ,H2 O2 和丙二醛 (MDA)含量显著增加。这些结果表明 ,H2 O2 积累与镍诱导的抗病作用密切有关     

创伤后巨噬细胞对T细胞白介素2及白介素2受体α基因表达的直接接触抑制作用

以25μg/ml的丝裂霉素C处理巨噬细胞30min,可阻断巨噬细胞白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)及前列腺素E_2(PGE_2)的合成与分泌。创伤小鼠巨噬细胞经丝裂霉素C处理后,可明显抑制正常T细胞白介素2(IL-2)mRNA及IL-2受体(IL-2R)αmRNA水平,并增强Ts细胞的抑制活性。去除T细胞中Ts细胞可使巨噬细胞的抑制作用消失。表明创伤后巨噬细胞可通过直接的细胞接触方式抑制T细胞IL-2及IL-2 Rα的基因表达,且这一作用是通过增加Ts细胞活性而实现的。     

2型糖尿病早期大鼠外周神经节基因表达谱分析

糖尿病神经病变(Diabetic neuropathy,DN)是糖尿病在神经系统发生的多种并发病变的总称。文章旨在筛选2型糖尿病早期大鼠外周神经节差异表达的基因。采用Illumina大鼠基因表达芯片,比较糖尿病模型与非糖尿病大鼠外周神经节基因表达谱差异。结果表明,全基因组12 604个已知基因中,158个基因差异表达。糖尿病组与非糖尿病组相比,87个基因表达上调,71个表达下调。对差异表达的基因进行GO分析,发现上调基因所参与的最显著(P<0.001)的几个生物学过程都与神经细胞骨架及运动功能有关;下调基因所参与的最显著的生物学过程主要与"对病毒/生物刺激/其它生物的反应"有关。KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析显示,差异表达的基因所参与的最显著(P<0.001)的生物学通路为代谢通路。结果表明:高血糖可导致糖尿病大鼠外周神经节代谢紊乱;高血糖可能通过免疫炎症反应、改变神经细胞骨架及运动功能相关的基因的表达,继而损害外周神经节的结构和功能。     

CO_2倍增和转Bt水稻对二化螟幼虫的生理影响

通过开顶式气室研究了CO2浓度倍增(750vs.375μL/L)对取食转Bt水稻及其对照亲本秀水11的二化螟Chilo suppressalis(Walker)幼虫体内代谢酶乙酰胆碱酯酶(AChE)和保护酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT)活力的影响,以期明确该类害虫对大气CO2浓度升高及转Bt水稻的生理响应。研究结果表明:(1)AChE受CO2浓度水平影响显著,与对照CO2处理相比,高CO2条件下该酶活力显著降低;(2)高CO2水平及水稻中Bt毒素蛋白的存在均会导致二化螟幼虫体内POD活力显著降低,SOD初期活力显著升高,但不能维持较长时间,CAT活力表现为先升后降的特点;(3)当受到水稻品种、CO2浓度水平和取食时间的综合影响时,以上代谢酶和保护酶活力会发生显著变化。短时间内二化螟幼虫可通过体内以上生理代谢调节减缓受CO2浓度升高和水稻中Bt毒素蛋白的不利影响,但长时间环境胁迫下这种应对不利环境的响应机制将会失去作用,最终导致种群适合度的降低。     

利用电转的方法对T细胞TET2基因敲除并探讨TET2对T细胞增殖的影响

近年来,利用重组病毒对T细胞进行基因编辑用于免疫治疗,受到了广泛重视。然而,重组病毒因存在随机整合,制备耗时长且昂贵的缺点制约了其应用。与此同时,电转染技术的应用能够快速将外源DNA带入细胞内,有助于提高T细胞基因编辑效率。TET(Ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC作为细胞中的DNA去甲基化酶,在细胞基因组表观遗传学中起着重要调控作用。研究表明TET2基因的缺失能够促进CAR-T细胞的快速繁殖,产生强力的CAR-T细胞。该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对TET2基因进行敲除。首先对sgRNA进行体外转录,与大肠杆菌诱导表达的Cas9蛋白孵育形成Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP),并在体外酶切验证sgRNA的活性。接着利用电转染技术将Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP)带入细胞内,并检测T细胞基因编辑效率。最后利用流式细胞分析技术检测T细胞的增殖情况。基因测序与T7EⅠ酶切结果表明,T细胞中的TET2基因被成功敲除,T细胞活力和功能并未受到影响。流式细胞技术,CCK-8以及台盼蓝细胞活率检测结果显示缺失Tet2蛋白后,T细胞的增殖速率明显快于野生型T细胞。该研究为非病毒载体替代传统的慢病毒载体构建携带嵌合抗原T细胞奠定了基础,具有制备周期短,安全性高的特点。同时TET2缺失促进了CAR-T细胞的增殖,使其能够引发有效的抗肿瘤反应,为CAR-T细胞免疫治疗提供了新的思路。     

外源糖对水稻Ugp1基因表达调控研究

植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）是蔗糖合成与降解途径的关键酶。本研究采用水稻叶片离体培养方法,结合Northern杂交技术,研究了外源糖对水稻Ugp1基因表达的影响。研究结果表明,蔗糖、葡萄糖、果糖、光照均能上调水稻Ugp1基因的表达,同时这种上调表达依赖于己糖激酶;果糖能上调水稻成熟叶片中Ugp1基因的表达,但并不影响苗期叶片中Ugp1基因的表达,具组织特异性;葡萄糖和果糖协同作用对Ugp1基因的诱导表达强于蔗糖,这种诱导除依赖于己糖激酶外,还存在其它未知的调控途径。水稻中存在UGPase的多种异构体,蔗糖及光照可诱导水稻Ugp1基因的上调表达,但对水稻UGPase的多种异构体形式并无影响。研究结果将有助于深入了解水稻Ugp1基因与糖信号途径互作调控网络。     

干旱高温胁迫下转基因水稻的生理变化

用PEG-6000、38℃及PEG-6000+38℃胁迫处理携带谷胱甘肽转移酶(GST)和过氧化氢酶(CAT1)的转基因水稻和非转基因水稻(Oryza sativa L.cv中花11), 并比较分析了二者在胁迫下的生理指标和抗氧化酶活性变化.结果显示,在单一PEG及PEG和高温复合胁迫下,植株生长、光合参数和相对含水量的降低幅度及H2O2和MDA(malon dialdehyde)的积累量在非转基因水稻与转基因水稻之间都有显著差异.在这2种胁迫下,转基因水稻的可溶性糖含量及CAT和POD (Peroxidase) 活性与非转基因水稻也有显著差异.这些结果表明,谷胱甘肽转移酶(GST)和过氧化氢酶(CAT1)的表达减轻了转基因水稻在单一干旱及干旱+高温复合胁迫下的伤害.     

山黧豆根系对H2O2诱导氧化胁迫的生理应答

以水培7d苗龄的山黧豆幼苗为材料,向水培溶液中施加不同浓度H2O2处理山黧豆幼苗24h,分析山黧豆根系受氧化胁迫的程度与抗氧化系统的应答特征,以揭示山黧豆对氧化胁迫的耐受机制。结果显示:(1)随外源H2O2处理浓度的不断增加,山黧豆幼苗侧根的数目无显著变化,而其根的鲜重则显著降低。(2)同时,根系组织的内源H2O2染色范围和程度显著增高,但根尖区域始终保持较低水平的H2O2;相反,O-·2染色范围和程度明显减少,根尖区域却始终保持较高水平的O-·2。(3)同期根系抗坏血酸(ASC)含量及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)与抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均表现出了先升高后降低的趋势,而超氧化物歧化酶(SOD)一直表现为持续上升的趋势。研究表明,在外源H2O2胁迫条件下,山黧豆根系O-·2的积累可能与其生长和活力呈正相关,而根系H2O2的积累则与其受氧化胁迫程度呈正相关;低浓度的H2O2处理可以提高山黧豆抗氧化系统对体内活性氧的清除能力。