运用MSAP技术测定谷子基因组DNA胞嘧啶甲基化水平

DNA甲基化是真核生物一种重要的表观修饰形式。为了探讨谷子基因组DNA胞嘧啶甲基化的水平和模式,以谷子Setaria italica的两个品种朝谷58号和豫谷1号为实验材料,利用Eco RⅠ和HpaⅡ/MspⅠ双酶切建立适合于谷子基因组的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系。结果表明,从100对MSAP选扩引物中,筛选出32对MSAP引物组合,在朝谷58号和豫谷1号中分别扩增产生1 615、1 482条清晰可辨且可重复的DNA条带,其中包括3种类型的甲基化条带,朝谷58号和豫谷1号的基因组中CCGG序列胞嘧啶甲基化水平分别为6.93%和8.77%。这种谷子不同品种间甲基化水平和分布位点的差异为从表观遗传学的角度培育新品种提供了初步的理论依据和参考。     

大花蕙兰子房授粉前后基因组DNA 胞嘧啶甲基化状态的MSAP 分析

应用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP) 技术分析了大花蕙兰( Cymbidium hybridium) 授粉前后子房DNA 甲基化状态的变化(甲基化水平和甲基化差异模式) 。采用72 对引物进行选择性扩增, 共得到5892 条带, 其中748 条带为甲基化多态性带。结果显示DNA 甲基化在大花蕙兰子房发育过程中发生频繁, 从授粉前后子房的总扩增位点甲基化水平(14%和11. 4%) 和全甲基化率(9.5%和7.8% ) 来看, 授粉后都略低于未授粉子房, 表明子房在授粉后的发育过程中在某些位点发生了去甲基化。除甲基化水平有变化外, 大花蕙兰子房授粉前后的DNA 甲基化模式也存在较大差异, 共检测到14 种带型, 分为两大类( Ⅰ 和Ⅱ 型)。其中, 授粉前后DNA 甲基化状态保持不变的位点少, 只占25.6% , 归为Ⅰ型; 大部分检测位点( 占74.4% , 归为Ⅱ型) 的DNA 甲基化模式在授粉前后存在显著差异。上述结果表明, 大花蕙兰子房发育过程中以DNA 甲基化为代表的表观遗传调控起重要作用。本研究的开展将促进对与大花蕙兰子房发育相关的甲基化差异片段及受DNA 甲基化调控的关键基因的克隆, 进而为从表观遗传学这一新角度揭示大花蕙兰子房发育的分子机制奠定基础。     

大花蕙兰子房授粉前后基因组DNA胞嘧啶甲基化状态的MSAP分析

应用甲基化敏感扩增多态性(Metyhfion sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术分析了大花蕙兰(Cymbidium hybridium)授粉前后子房DNA甲基化状态的变化(甲基化水平和甲基化差异模式).采用72对引物进行选择性扩增,共得到5892条带,其中748条带为甲基化多态性带.结果显示DNA甲基化在大花蕙兰子房发育过程中发牛频繁,从授粉前后子房的总扩增位点甲基化水平(14%和11.4%)和全甲基化率(9.5%和7.8%)来看,授粉后都略低于未授粉子房,表明子房在授粉后的发育过程中在某些位点发生了去甲基化.除甲基化水平有变化外,大花蕙兰子房授粉前后的DNA甲幕化模式也存在较大差异,共榆测到14种带型,分为两大类(Ⅰ和Ⅱ型).其中,授粉前后DNA甲基化状态保持不变的位点较少,只占25.6%,归为Ⅰ型;大部分榆测位点(占74.4%,归为Ⅱ型)的DNA甲基化模式在授粉前后存在显著差异.上述结果表明,大化蕙兰子房发育过程中以DNA甲基化为代表的表观遗传调控起重要作用.本研究的开展将促进对与大花蕙兰子房发育相关的甲基化差异片段及受DNA甲基化调控的关键基因的克隆,进而为从表观遗传学这一新角度揭示大花蕙兰子房发育的分子机制奠定基础.     

叶锈菌胁迫下的小麦基因组MSAP分析

内源DNA甲基化是真核生物表观遗传调控的重要组成部分, 在真核生物的基因表达调控中具有重要的作用。生物胁迫为植物提供一种内在的表观遗传进化动力。研究生物胁迫下DNA甲基化的变异模式, 有助于全面理解DNA甲基化的表观调控生物学功能。小麦近等基因系TcLr19、TcLr41及其感病亲本Thatcher在苗期对叶锈菌生理小种THTT、TKTJ分别表现为小种特异性抗病反应和感病反应。文章利用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplified polymorphism, MSAP)技术分析了小麦的甲基化水平, 同时比较了苗期在生物胁迫前后基因组DNA胞嘧啶甲基化模式。用60对MSAP引物对接种前后的小麦DNA进行全基因组筛选, 没有直接分离得到接菌前后的甲基化模式的差异, 结果初步表明, 叶锈菌并没有诱导稳定且特异的植物基因组DNA胞嘧啶位点的甲基化模式变化, 但发现TcLr41及其感病亲本Thatcher之间存在表观遗传学差异。     

盐胁迫下棉花基因组基于毛细管电泳的MSAP分析

以棉花杂交种中棉所29为材料,用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP) 分析法结合毛细管电泳检测技术进行甲基化鉴定,以初步探讨棉花耐盐的分子机理．应用24个引物组合,中棉所29在0.4%盐水胁迫及清水对照下,平均每引物组合检测甲基化位点数分别为69.2和56.7,差异达显著水平．盐胁迫下的DNA甲基化水平与清水对照下相比,52.6%位点表现出甲基化水平提高,即发生了超甲基化;19.7%位点甲基化水平降低,即表现为次甲基化;二者差异达极显著水平．研究结果表明,中棉所29盐胁迫后发生了广泛的DNA甲基化变化,包括超甲基化和次甲基化,以及其它甲基化类型的转变|发生超甲基化位点极显著地多于发生次甲基化位点．盐胁迫下的中棉所29与对照相比,DNA总体甲基化水平显著提高,暗示中棉所29有提高基因组甲基化水平以应对盐胁迫的潜在机制,棉花基因组整体甲基化水平的提高可能与棉花对盐胁迫的耐受性起重要作用．本研究中,甲基化序列的初步克隆及比对分析表明,盐胁迫前后多个ATP合成相关基因甲基化程度维持在同一水平,其表达不受甲基化影响,这也可能是中棉所29耐盐性较强,在一定时间盐处理后能维持正常生长的原因之一．     

贵州不同地区白三叶基因组甲基化MSAP分析

对来自贵州6个不同地区的白三叶基因组进行甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)分析。结果表明:分析选出24对MSAP选扩增引物,共扩增产生7 643个位点,独山、赫章、晴隆、印江、天柱和从江地区白三叶扩增的位点数分别为1 211、1 348、1 297、1 300、1 255和1 232。其中总甲基化位点分别占73.37%、68.13%、71.68%、65.43%、70.41%和70.51%;全甲基化位点分别占55.32%、49.76%、53.20%、50.61%、51.35%和54.21%,表明白三叶基因组甲基化主要以双链甲基化为主。进一步分析不同地区白三叶之间甲基化模式的变化,结果显示:未发生甲基化模式改变的均值占36.22%;发生甲基化模式改变的比例均值为59.61%,其中去甲基化模式为29.15%,甲基化模式为30.46%,表明基因组发生甲基化和去甲基化比例超过未发生甲基化的比例。本研究中不同地区野生白三叶甲基化水平各不相同,同时各个地区之间甲基化模式变化也有差异,说明白三叶发生基因组甲基化具有时空特异性。     

土霉素胁迫下拟南芥基因组DNA甲基化的MSAP分析

以拟南芥 (Arabidopsis thaliana)为材料,研究不同土霉素浓度下拟南芥幼苗生长发育及基因组DNA的甲基化水平和变化模式。结果表明,3、5、7\,9 μmol/L土霉素胁迫对拟南芥幼苗的根长和株高有显著抑制作用;但对拟南芥幼苗的侧根数量有显著促进作用。甲基化敏感扩增多态性 (methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)分析表明,经3、5、7\,9 μmol/L土霉素处理后基因组DNA甲基化比率分别为17.91%、12.50%、11.81%和14.62%,均低于对照 (18.18%)。结果表明,拟南芥经土霉素胁迫后存在基于 DNA甲基化水平和模式改变的表观遗传变异,5-甲基胞嘧啶百分含量的变化无统一趋势或规律。与对照相比,3、5、7\,9 μmol/L土霉素胁迫下拟南芥幼苗基因组DNA的甲基化和去甲基化分别为13.29%、9.22%、8.03%、12.59%和2.80%、4.26％、5.11%、4.90％。由此推测,DNA甲基化可能是植物适应土霉素胁迫机制的机制之一。     

镉胁迫下萝卜基因组DNA甲基化敏感扩增多态性分析

应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析了重金属镉(cd)胁迫处理后萝卜基因组DNA甲基化程度的变化。结果表明,经50、250和500mg/L CdCl_2处理后,MSAP比率分别为37%、43%和51%,均高于对照(34%);全甲基化率(双链C~mCGG)分别为23%、25%和27%,而其对照为22%,表明重金属CdCl_2胁迫后,某些位点发生了重新甲基化。萝卜叶片DNA中总甲基化水平的增加与CdCl_2处理浓度呈显著正相关。甲基化变异可分为重新甲基化、去甲基化、不定类型以及与对照相同的甲基化模式等类型,Cd胁迫处理引起的植株基因组DNA甲基化程度的提高主要是重新甲基化。     

MSAP技术在植物抗逆性方面的应用

DNA甲基化在植物的生长发育中起着重要的作用。近年来,随着对DNA甲基化研究的重视,基于PCR方法检测DNA甲基化水平的甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)得到广泛的应用。综述了MSAP技术在植物的生物与非生物胁迫研究方面的应用。     

蒙古黄芪响应反复干旱胁迫的代谢机制

【目的】蒙古黄芪是黄芪药材的重要基原植物,其主要种植地内蒙古、山西、甘肃等地均属于干旱半干旱地区,不定期的间歇式降雨造成了植物干旱复水循环。研究黄芪在干旱及复水过程中代谢产物的变化特征对于了解其响应自然间歇降雨的干旱胁迫机制非常关键。【方法】试验以一年生蒙古黄芪种苗为材料,进行反复干旱胁迫及复水处理后,测定盆栽土壤养分及其根长、根粗,采用基于NMR的代谢组学技术分析蒙古黄芪的初生差异代谢物,并进行差异代谢物筛选及代谢通路分析;采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法、香草醛-冰醋酸比色法和苯酚-硫酸比色法测定反复干旱胁迫处理下蒙古黄芪根中总黄酮、总皂苷及多糖物质含量。【结果】（1）蒙古黄芪在面临干旱胁迫时会呈现根粗减小,根长和须根密度增加的趋势;（2）干旱及复水处理下,代谢组共检测到42种代谢产物,主要是氨基酸及其衍生物、有机酸、胺类及氨类化合物和糖类等;代谢通路分析发现,植株在反复干旱胁迫过程中主要会影响体内的氨基酸代谢途径,通过增加天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸及精氨酸的含量,降低天冬酰胺、色氨酸和4-氨基丁酸和含量来增强自身抗旱性,具体表现为丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸等代谢物增加1～3倍,色氨酸和4-氨基丁酸等代谢物下降约1～2倍。（3）在第1轮干旱胁迫下黄芪总皂苷积累,而第2轮干旱胁迫后黄芪皂苷、总黄酮类、多糖3种活性物质的生成量减少,均呈现下降趋势。【结论】氨基酸及其衍生物类与蒙古黄芪响应水分胁迫的机制密切相关,同时植株本身也会调节自身的次生代谢产物以响应环境变化。     

常压下强电场辐射对国稻6号DNA甲基化的影响

目的:研究常压下强电场辐射对国稻6号DNA甲基化的影响.方法:常压下在相同时间下,以不同强度(和在相同强度下,以不同时间)辐射国稻6号种子,应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术,研究在不同辐射条件下,水稻基因组DNA甲基化的水平及差异.结果:所有强电场辐射的试验组甲基化水平都比未辐射的对照组有所降低,并与辐射的时间和强度有关.细胞DNA全甲基化、半甲基化扩增位点占总扩增位点的比例为:12.89％～13.62％,3.36％～4.63％,随着辐射强度和时间的增加有所降低.结论:说明经强电场辐射的国稻6号水稻基因组DNA甲基化较亲本发生了明显的变异,强电场能引起表观遗传变异,为研究其规律奠定了基础,也为探讨水稻甲基化对水稻生长调控的分子机理提供了帮助.     

干旱胁迫对蒙古黄芪生长及根部次生代谢物含量的影响

以山西道地药材黄芪一年生幼苗为试验材料,设置常规水分条件(CK)、轻度干旱胁迫(A1)、中度干旱胁迫(A2)、重度干旱胁迫(A3)4个不同处理,研究土壤干旱胁迫对黄芪生长及生理的影响。结果表明:黄芪茎叶快速生长集中在出苗后80—120d,以后生长减缓;当茎叶枯萎时,根中生物量短期快速积累。与常规水分条件相比,干旱胁迫处理显著降低了黄芪苗高及茎叶生物量,但对抗氧化能力、根系生长及次生代谢物积累产生了不同的影响。轻度干旱胁迫下SOD、POD、CAT 3种抗氧化酶活性升高,丙二醛(MDA)含量和细胞膜透性降低,同时根长与根生物量增加、多糖与皂苷两种次生代谢物积累增多,黄芪药材的质量得到显著提高(P0.05);胁迫上升到中度、重度时,SOD酶活性逐渐降低,重度胁迫下低于对照,而POD及CAT酶活性、MDA含量、细胞膜透性均随胁迫增强而升高,相反,根长、根生物量、多糖与皂苷含量降低,导致黄芪药材的质量显著降低(P0.01)。综上表明,干旱胁迫下,SOD酶表现较为敏感,可能在清除活性氧中起主要作用;轻度水分胁迫能有效启动黄芪体内抗氧化酶系统和次生代谢,它们相互协作共同对抗胁迫对细胞产生的伤害,通过降低地上部分的生长,将营养物质优先运往根部,促进根产量及药材质量的提高。这一结论,可在黄芪多糖和皂苷次生代谢物定向培育的水分管理中加以利用。     

干旱胁迫对蒙古黄芪生长和生理生化指标及其黄芪甲苷积累的影响

以二年生蒙古黄芪实生苗为试验材料,采用盆栽模拟自然界干旱的方法,连续控水14d,分析持续性干旱胁迫对蒙古黄芪实生苗生长、生理生化指标及其黄芪甲苷的影响。结果显示:(1)随着土壤相对含水量的降低,黄芪叶片相对含水量逐渐降低,而其中丙二醛含量升高,其根茎干重也降低。(2)随着胁迫时间的延长,黄芪根叶中抗氧化酶类SOD、POD、CAT、APX和GR活性呈先增加后降低的趋势,根中最高值较对照分别增加了72.1%、108.6%、178.0%、299.4%和303.4%,且根叶中渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖含量也逐渐升高。(3)黄芪甲苷积累量在干旱胁迫第12天达到最大,比对照增加了53.0%,随后降低。研究表明,随着干旱胁迫程度的加深,黄芪苗生长受到一定程度抑制,但能通过调节自身保护酶活性和渗透调节物质含量来减轻干旱的损伤,最大程度地维持植株的正常代谢;适度水分胁迫有利于黄芪甲苷的积累,而重度胁迫不利于其积累。     

不同倍性西瓜基因组DNA甲基化水平与模式的MSAP分析

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一,在基因表达调控中发挥重要作用。本研究以不同倍性（2x、3x、4x）西瓜为试材,采用基于DNA甲基化敏感酶的扩增多态性分析（Methylation-Sensitive Ampliftcation Polymorphism,MSAP）方法,在全基因组水平上探究西瓜同源多倍化过程中DNA序列中CCGG位点的甲基化水平及模式变化特征。研究中选用23对选扩引物,共检测到1883个基因位点。二倍体、三倍体、四倍体中检测到的位点数分别为647、655和581;其中发生甲基化的位点数分别为181、150和159。相应的扩增总甲基化率分别为28．0％、22．9％和27．4％：全甲基化位点数分别为121、80和82,相应的全甲基化率分别为18．7％、12．2％和14．1％。进一步对不同倍性西瓜DNA甲基化模式的变化特征进行分析,结果显示：四倍体西瓜与二倍体西瓜相比有超过半数的位点（54．4％）DNA甲基化模式发生了变化,其与三倍体西瓜相比也有近一半的位点（45．4％）DNA甲基化模式发生了变化,并且变化趋势都以四倍体西瓜甲基化程度升高为主：而三倍体西瓜与二倍体西瓜相比．虽然也有41．6％的位点DNA甲基化模式发生了改变,但变化趋势以三倍体西瓜甲基化程度降低略占优势：与之相似,三倍体西瓜与四倍体相比较。甲基化的变化趋势也是以三倍体西瓜甲基化程度降低为主。以上结果表明：不同倍性西瓜中DNA甲基化事件虽均有发生．但不论是从总甲基化率还是全甲基化率来看,DNA甲基化水平与倍性高低关系不大．三倍体西瓜表现出较为显著的低甲基化水平特征。DNA甲基化模式的分析也表明。与二倍体及四倍体西瓜相比．三倍体西瓜DNA甲基化模式的调整主要以去甲基化为主。显示出三倍体西瓜基因组独特的DNA甲基化特征。本研究为进一步从表观遗传学的角度探讨西瓜的三倍体优?     

高温胁迫下水稻基因组DNA表观遗传变化MSAP分析

目的:研究高温胁迫对水稻基因组DNA甲基化变化的影响,筛选出一批与高温胁迫的相关基因,研究DNA基因化与基因转录水平之间的关系。方法:在人工气候箱子中,对四叶期的水稻幼苗进行38度高温处理,分别取0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h七个不同时间点的幼叶提取DNA与RNA,利用MSAP技术检测总甲基化水平变化,RT-PCR检测相关基因的转录本的表达量变化。结果:与对照组0 h幼叶相比,高温处理下的2 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h幼叶的总体甲基化水平依次是37.14%、36.79%、36.00%、35.50%、35.43%、34.64%和34.57%,可知幼叶DNA甲基化水平在高温处理后不断降低。此外,RT-PCR结果显示筛选的两个与甲基化相关的基因(PP2C和RAFP)的转录水平与甲基化水平呈负相关。结论:基因组甲基化作为一种重要的表观遗传调控方式,可以通过调控相关的基因的表达量水平来防御高温胁迫。     

非生物胁迫下植物表观遗传变异的研究进展

植物在整个生命过程中固着生长,不能主动躲避外界不良环境的危害,需要通过自身的防御机制来抵御和适应外界胁迫,而表观遗传修饰在调控植物应对不良环境胁迫中起重要作用。该文从DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA等方面进行了综述,主要阐述了近年来国内外有关非生物胁迫下植物的表观遗传变化,以期为利用表观遗传变异提高植物的抗胁迫能力提供参考。     

非生物胁迫下水稻OsMATE基因表达分析

从水稻(Oryza sativa L.)叶片中克隆到与高粱(Sorghum bicolor) SbMATE最相似的同源基因OsMATE,利用半定量RT-PCR分析了OsMATE在水稻不同组织、不同非生物胁迫以及抗铝和铝敏感水稻品种中的表达。结果表明,OsMATE在水稻根和叶中表达非常低,叶鞘中几乎没有表达;铝、镉、砷、盐、铁、PEG6000、百草枯和ABA等非生物胁迫都可以诱导水稻根OsMATE的大量表达,而在水稻叶中,只有砷、盐和PEG6000可以少量诱导OsMATE的表达;并且铝毒胁迫下抗铝品种根中OsMATE的表达明显高于铝敏感品种。这说明非生物胁迫下OsMATE在水稻抗逆中可能发挥重要作用。     

应用MSAP方法检测鸡不同组织基因组的甲基化状态

以白洛克肉鸡和白来航蛋鸡及其杂交F1代基因组为实验材料,应用甲基敏感扩增片段多态性方法(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)检测了鸡肌肉、心脏、肝脏和肾脏4个不同组织基因组在CCGG位点的甲基化状态,分析了不同组织的DNA甲基化水平及组织特异性甲基化模式。研究发现:肌肉组织的甲基化水平约为29.7%,肝脏组织约为27.5%,心脏组织约为27.5%,肾脏组织约为26.1%;在鸡3个不同群体及其中3个不同组织间,基因组甲基化程度差异显著(P<0.05);在检测的4个组织中,CCGG序列的全甲基化位点少于半甲基化位点,与植物的相关研究不一致;分离及鉴定了2个组织特异的甲基化片段。结果表明:鸡不同组织基因组的甲基化状态是不同的,同一组织的甲基化水平在不同的群体是不同的,而不同组织甲基化水平的排序在不同的群体是不一致的。这些结果揭示遗传效应可能影响个体的组织甲基化水平。     

核黄素参与水稻非生物胁迫响应的分析

为探究核黄素在水稻非生物胁迫响应中的作用,以粳稻Kitaake和籼稻T98B为试验材料,考察了核黄素对2种材料的盐、高温、渗透、碱和氧化胁迫响应的影响,重点测定了盐和高温胁迫下水稻体内核黄素合成基因的表达和相关生理指标。结果表明,(1)施加外源核黄素有效提高了2种水稻材料的盐和高温胁迫耐受性,降低了渗透胁迫耐受性,而其氧化和碱胁迫耐受性不受影响。(2)逆境胁迫均不同程度地促进了核黄素在2种水稻材料中的积累,尤其在盐和高温胁迫下促进效果最明显。(3)盐和高温胁迫均诱导了核黄素合成酶基因的表达,促进了核黄素的生物合成,改善了水稻的胁迫耐受性。研究表明,非生物逆境胁迫能促进核黄素在水稻体内的合成和积累,外源核黄素也能明显提高水稻对盐和高温胁迫的耐受性,但却降低了其对渗透胁迫的耐受性。