甜樱桃(Prunus avium L.)品种S基因型鉴定

根据蔷薇科S-RNase基因(S基因)高度保守区C2和RC4区设计一对特异引物PruC2和PruC4R,对甜樱桃品种的基因组DNA进行S基因特异PCR扩增。克隆S基因的扩增片段,核酸序列在GenBank上搜索,确定了4种S基因的核酸序列和大小。结果表明,在琼脂糖凝胶上位置相同的扩增带其核酸序列相同,是同一种S基因。4种S基因扩增片段的大小分别是：S1为677bp,S3为762bp,S4为945bp,S6为456bp。参试的自交不亲和品种的S基因型分别是：红灯、红艳、早红宝石和先锋相同,为S1S3;抉择、红丰和那翁相同,为S3S4;大紫为S1S6;长把红为S1S4;养老为S2S6;自交亲和品种外引7号和斯太拉为S3S4。     

汉坦病毒S基因片段及其产物的研究

汉坦病毒是肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）的病原体,近年来对其Ｓ基因片段生物学特性的研究取得了很大进展。本文不Ｓ基因片段的结构、编码核蛋白（ＮＰ）的免疫原性、抗原决定簇及ＮＰ的重组表达与应用一阐述。     

汉滩病毒M和S基因不同拼接方式嵌合基因免疫效果的研究

本文在前期工作的基础上,构建了汉滩病毒76－118株M基因G2片段与S基因5'端0.7Kb片段的嵌合基因真核表达载体pcDNA3.1-G2S0.7及pcDNA3.1-S0．7G2;用该质粒免疫BALB/c小鼠,结果表明两种质粒免疫小鼠可同时诱导产生抗滩滩病核蛋白（NP)及糖蛋白（GP）特异性的抗体,且前者刺激产生的抗体效价明显高于后者。淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1-G2S0.7组免疫小鼠脾细胞时NP及GP的增殖指数均明显高于空载体对照组,而pcDNA3.1-S0．7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖。这说明汉滩病毒M基因G2片段及S基因0.7Kb片段的嵌合基因既可刺激机体产生特异的抗汉滩病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异的细胞免疫应答。不同拼接方式对嵌合基因免疫效果有很大影响,嵌合基因G2S0．7这种拼接方式明显优于S0．7G2。     

基于12S和16S rRNA序列的湍蛙属部分物种的系统发育关系

测定了湍蛙属 6个种共 10个种群 ,以及 4个外群种的线粒体 12S和 16SrRNA基因片段 ,比对后有94 0bp序列 ,发现 35 2个变异位点、 186个简约性位点。运用NJ法、MP法、ML法构建了系统关系树 ,各系统树一致表明内群为一单系群 ,分为两组 :第一组中 ,四川湍蛙两种群先聚合 ,再和棕点湍蛙聚为一支 ;第二组中 ,香港湍蛙和戴云湍蛙聚为一支 ,而香港大屿山离岛湍蛙种群首先与华南湍蛙相聚 ,再与武夷湍蛙构成姐妹支。研究结果表明 :香港地区增加 1种湍蛙分布 ;戴云湍蛙是一有效种 ;四川湍蛙的石棉和洪雅种群间遗传差异达到或超过其他种间的分歧水平。     

基于12S rRNA和16S rRNA基因序列探讨中国蚤蝇科部分属间的系统发育关系

基于线粒体12S rRNA和16S rRNA基因序列联合分析,采用最大简约法、最大似然法和贝叶斯法分别构建了中国蚤蝇科14属的系统发育树.结果表明:联合分析序列总长度为819 bp,其中可变位点277个,简约信息位点200个;A+T平均含量为77.7%,具A、T偏倚性.系统发育分析显:中国蚤蝇科为单系发生,分为蚤蝇亚科和裂蚤蝇亚科两个单系群.蚤蝇亚科内脉蚤蝇属、锥蚤蝇属和刺蚤蝇属亲缘关系较近,栅蚤蝇属与栓蚤蝇属亲缘关系较近;裂蚤蝇亚科中虼蚤蝇属与裂蚤蝇属互为姐妹群,寡蚤蝇属与伐蚤蝇属互为姐妹群.     

修饰的含前S1、前S2免疫决定簇乙肝表面抗原融合多肽在毕赤酵母中的共表达

用BamHⅠ和BglⅡ双酶切含SS2嵌合基因片段的重组质粒pAO815-SS2,分离含AOX1启动子区、SS2嵌合基因和AOX1转录终止序列的表达盒。将分离的BamHⅠ-BglⅡ表达盒与经BamHⅠ线性化的pAO815-SS1质粒连接,转化大肠杆菌Top10F′,提取质粒,用BamHⅠ和BglⅡ双酶切分析重组质粒并筛选正向插入SS2表达盒的重组子。将该重组质粒用电转化法导入PichiapastorisGS115细胞,经表型筛选、小试表达和产物鉴定,构建了重组表达菌株GS115-SS1S2。重组菌株经甲醇诱导后制备抗原粗提液,进一步进行ELISA和Westernblot鉴定。ELISA结果显示,产物同时具有S、前S1和前S2抗原性。Westernblot分析进一步表明,表达产物既能与S抗体结合,也能与前S1和前S2抗体结合。工程菌经高密度发酵,表达量达到300~600mg/L。抗原经纯化后进行电镜观察,形成直径20~35nm的球形颗粒。纯化抗原经SDS-PAGE分析,SS1和SS2多肽仍然保持完整,基本无降解。     

汉滩病毒M和S基因不同拼接方式嵌合基因免疫效果的研究

本文在前期工作的基础上,构建了汉滩病毒76-118株M基因G2片段与S基因5'端0.7Kb片段的嵌合基因真核表达载体pcDNA3.1-G2S0.7及pcDNA3.1-S0.7G2;用该质粒免疫BALB/c小鼠,结果表明两种质粒免疫小鼠可同时诱导产生抗汉滩病毒核蛋白(NP)及糖蛋白(GP)特异性的抗体,且前者刺激产生的抗体效价明显高于后者.淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1-G2S0.7组免疫小鼠脾细胞时NP及GP的增殖指数均明显高于空载体对照组,而pcDNA3.1-S0.7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖.这说明汉滩病毒M基因G2片段及S基因0.7Kb片段的嵌合基因既可刺激机体产生特异的抗汉滩病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异的细胞免疫应答.不同拼接方式对嵌合基因免疫效果有很大影响,嵌合基因G2S0.7这种拼接方式明显优于S0.7G2.     

大黄鱼16SrRNA和18SrRNA基因的测定与序列分析

利用多对引物,扩增并测定出大黄鱼16SrRNA基因和18SrRNA基因的部分序列,其长度分别为1202bp和1275bp,16SrRNA基因序列的GC含量为46．12％,18SrRNA基因的Gc含量为53．oo％。将大黄鱼16SrRNA基因序列与GenBank中15种硬骨鱼类的同源序列结合,同时将其18SrRNA基因序列与GenBank中9种脊索动物的同源序列相结合,运用软件获得各自序列间差异百分比,转换和颠换数值等信息。基于这两种基因序列,利用NJ法和BI法,分别构建16种硬骨鱼类和10种脊索动物的分子系统树。18SrRNA构建的系统树包括三大支,一支为哺乳类、鸟类和爬行类共6个物种,一支为两栖类的1个物种,另一支为2种硬骨鱼类。16SrRNA构建的系统树显示大黄鱼所在的石首鱼科与鲈科和盖刺鱼科亲缘关系较近。此外还讨论了这两个基因的序列特征。     

从HFRS患者的PBMC建立BLCL及其意义

体外研究汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)S基因及其5’端、3’端在BLCL(EBV-transformed B lymphoblastoid cell line,BLCL)内稳定表达的意义,为核蛋白T细胞表位的研究奠定基础。本研究从肾综合征出血热(HFRS)患者的外周血单个核细胞(PBMC)建立与HTNV特异性CTL同源的患者自身的EB病毒转化的B淋巴母细胞系,将含有不同HTNVS基因片段的重组真核表达载体转染入BLCL,获得长期稳定表达,作为靶细胞系,为下～步进行CTL杀伤试验提供靶细胞系。设计4条引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出s基因全读码框(37—1326bp)及s基因5’端(37—501bp),S基因3’端(502—1326bp),用TA克隆将其克隆入pcDNA3．1／V5．His-TOPO载体中,成功构建pcDNA3．1-S及pcDNA3．1-S—N、pcDNA3．1-S-C真核表达载体,并通过脂质体转染至BLCL细胞中,进行了稳定表达。间接免疫荧光成功检测到pcDNA3．1-S及pcDNA3．1-S-N、pcDNA3．1-S．C在BLCL细胞中的表达。pcDNA3．1-S及pcDNA3．1-S—N、pcDNA3．1一S—C真核表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中长期稳定表达,有利于研究HTNV-S基因在T细胞表位研究中的意义。建立的特异性CTL克隆对表达完整NP、NP羧基和氨基端肽段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应,平均杀伤率分别为50．2％、39．0％和25-4％。HTNV-NP优势T细胞表位可能主要位于病毒核蛋白的羧基端。     

欧李自交不亲和S基因的克隆及序列分析

以6株欧李优选株系为实验材料,利用引物EM-PC2consFD和EM-PC3consRD对欧李进行S等位基因的专一性PCR扩增、克隆测序,获得了9个大小不同的序列,经BLAST分析确定为欧李的9个新S基因,分别命名为S1~S9,GenBank登录号依次为EF569602、EF569603、EF577404、EF577405、EF595836、EF595837、EF601047、EF653137、EF653138,并确定了6株欧李优选株系的S基因型。依据欧李的9个新S基因和李属其它S基因构建系统树,聚类结果显示李、杏、梅、欧李、扁桃及甜樱桃种间相互交叉,表明李属果树的S基因起源于共同的祖先;李、杏、梅、扁桃及甜樱桃应归为一个属,即李属;并初步探讨了欧李的分类地位。     

白梨和砂梨S基因型确定及S34新基因的分离

梨是配子体型自交不亲和植物,确定不同品种的S基因型是科学杂交授粉及提高梨产量和品质的基础。本文根据砂梨S1-9等位基因一级结构特征,设计特异引物PF和PR,以白梨（Pyrus bretschneideri）种鹅梨（Pyrus bretschneideri‘Eli’）和砂梨（Pyrus pyrifolia）品种博多青（Pyrus pyrifolia‘Hakataao’）的叶片基因组DNA为模板,通过PCR·RFLP系统检测、克隆测序以及生物信息学分析,分离鉴定了它们的片段大小相似的2条S等位基因,从中获得1条新的S基因,命名为S34-RNase基因,并确定了这2个梨品种的S基因型,分别为鹅梨S13S34和博多青S22S34。     

白梨和砂梨S基因型确定及S34新基因的分离

梨是配子体型自交不亲和植物, 确定不同品种的S基因型是科学杂交授粉及提高梨产量和品质的基础。本文根据砂梨S1-9等位基因一级结构特征, 设计特异引物PF和PR, 以白梨(Pyrus bretschneideri)品种鹅梨(Pyrus bretschneideri ‘El i’) 和砂梨(Pyrus pyrifolia)品种博多青(Pyrus pyri folia ‘Hakataao’) 的叶片基因组DNA为模板, 通过 PCR-RFLP系统检测、克隆测 序以及生物信息学分析, 分离鉴定了它们的片段大小相似的2条S等位基因, 从中获得1条新的S基因, 命名为S34-RNase基因, 并确定了这2个梨品种的S基因型, 分别为鹅梨S13S34和博多青S22S34。     

欧李自交不亲和JS基因的克隆及序列分析

以6株欧李优选株系为实验材料,利用引物EM—PC2consFD和EM—PC3consRD对欧李进行S等位基因的专一性PCR扩增、克隆测序,获得了9个大小不同的序列,经BLAST分析确定为欧李的9个新S基因,分别命名为S1～S9,GenBank登录号依次为EF569602、EF569603、EF577404、EF577405、EF595836、EF595837、EF601047、EF653137、EF653138,并确定了6株欧李优选株系的S基因型。依据欧李的9个新S基因和李属其它S基因构建系统树,聚类结果显示李、杏、梅、欧李、扁桃及甜樱桃种间相互交叉,表明李属果树的S基因起源于共同的祖先;李、杏、梅、扁桃及甜樱桃应归为一个属,即李属;并初步探讨了欧李的分类地位。     

汉滩病毒S基因及其5‘端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｓ基因及其５'端表达的意义,为核蛋　白Ｔ细胞表位的研究奠定基础。设计２套引物,用ＰＣＲ方法从ＰＢＶ２２０－Ｓ２２原核质粒中扩增出Ｓ　基因全读码框（３７－１３２６ｂｐ）及Ｓ基因５'端（３７－５０１ｂｐ）,用ＴＡ克隆将其克隆入ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ载体中,成功构建ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体,并通过脂质体转　染至Ｖｅｒｏ细胞中,进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ在Ｖｅｒｏ细胞中的表达。ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体有较高的转染效率,目　的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究ＨＴＮＶ－Ｓ基因在Ｔ细胞表位研究中的意义。     

汉滩病毒S基因及其5'端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒(HTNV)S基因及其5'端表达的意义,为核蛋白T细胞表位的研究奠定基础.设计2套引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出S基因全读码框(37-1326bp)及S基因5'端(37-501bp),用TA克隆将其克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,成功构建pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体,并通过脂质体转染至Vero细胞中,进行了瞬时表达.间接免疫荧光成功检测到pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N在Vero细胞中的表达.pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究HTNV-S基因在T细胞表位研究中的意义.     

大头蛙和脆皮大头蛙线粒体3个基因的测定及两栖类亲缘关系研究

现存的两栖类系统发生关系一直存在争议,特别是3个目间的亲缘关系。本文设计了5对引物,扩增和测定了大头蛙和脆皮大头蛙线粒体12S和16S rRNA基因和Cytb基因的全序列。在对所测序列进行分析的同时,基于3个基因全序列的相加数据,运用MEGA 3.1和PHYLIP 3.64软件中的NJ法、MP法和ML法,对两爬类17个物种,以鱼类非洲肺鱼为外群,重建出3个树形完全一致的分子系统树。研究结果显示:现存两栖类中无尾目和有尾目为姐妹群关系,并推断有尾目内小鲵科和隐鳃鲵科亲缘关系较近。此外,在研究两栖类系统发生关系方面,作者分析前人研究中产生两种不同观点的可能原因,同时总结了在此类研究中产生偏差的几种影响因素。     

乙型肝炎病毒PreS2S基因在毕赤酵母中表达的研究

构建重组质粒PHIL-D2/PreS2S以研究乙肝病毒PreS2(120-146)S基因编码蛋白在毕赤酵母中的表达。通过PCR扩增获得PreS2S片段,插入含AOX1启动子的Pichia Pastoris表达载体PHIL-D2中,构建重组表达质粒PHIL-D2/PreS2S,转化酵母宿主菌GS115。挑取阳性克隆摇床培养,甲醇诱导表达。通过ELISA、RPHA鉴定表达产物。成功构建了PHIL-D2/PreS2S真核表达载体,经过序列分析,插入的基因为在中国流行的adr亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了S蛋白,S蛋白的表达量为34.9 mg/L,PreS2抗原检测为强阳性。利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的PreS2S蛋白,PreS2S蛋白具有良好的生物学活性。     

从线粒体基因探讨中国大头蛙群的分类及其属内地位

Partial sequences of the mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA gene were determined for 8 populations of three species of Chinese Limnonectes, and aligned with the published sequences of Limnonectes from other parts of the world. When Nanorana parker, Paa boulengeri, Fejervarya limnocharis and Hoplobatrachus rugulosus was used as outgroup taxa (Accession Nos. AY158705, AY313685, AF206111, AF206491, AY322311). The sequences of the 12S rRNA and 16S rRNA genes totaled 950 nueleotide positions with gaps including 510 variable sites. We reconstructed phylogenetie trees using Clustal X 1.8, Mega 2.1 and PHYLIP 3.5e software, and using the maximum parsimony and maximum likelihood methods, respectively. Our analyses suggest that these fanged frogs from China are another monophyletie group in addition to the four monophyletie groups identified by previous studies. The Chinese Limnonectes were grouped into three elades (BCL 55% ). The first elade contains one species (BCL 100% ), from a population of Limnoneetes fragilis from Hainan Province. The second contains four individuals (BCL 100% ), i. e. two populations of Limnonectes kuhlii from Yunnan Province. The third contains one species (BCL 100% ), i. e. five populations of Limnonectes fujianensis from Fujian Province and 1 from Taiwan Province. The resulted phylogenetie trees indicate L. fragilis is basal to L. kuhlii L. fujianensis 。