幽门螺杆菌过氧化氢酶基因的克隆、序列测定及其生物信息学分析

幽门螺杆菌(Helicobacter pylorl,Hp)感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃腺癌、胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生亦密切相关。其有效抗原成份过氧化氢酶可刺激机体产生保护性的免疫反应。用高保真PCR扩增系统扩增出过氧化氢酶基因片段,将其定向插入载体pET-22b( ),对其全序列进行了测定。并以生物信息学软件分析其生物学特性。克隆的过氧化氢酶基因序列与报道的序列完全一致,并显示出良好的抗原性和疏水性。这一研究获得了序列正确的过氧化氢酶基因,为将来以过氧化氢酶分子作抗原的Hp疫苗研制工作打下了良好基础。     

青岛文昌鱼LIM类基因Bblim同源框区的cDNA克隆、序列分析及其在胚胎发育中的表达

不同卵裂球发育命运的特化、亦即胚胎细胞的分化是动物胚胎发育的重要特征。多数胚胎细胞尽管形态特征完全一致,却具有不同的发育命运。预示着：在这些细胞中存在有决定发育命运的因素－决定子。本工作克隆了青岛文昌鱼LIM类同源框基因的同源框片段。目的在于揭示决定子的分子本质。青岛近海采集性成熟的成年青岛文昌鱼,收集未受精卵、受精卵以及各处不同时期的胚胎,液氮冻存备用。分别制备总RNA。根据其它动物LIM类同源框基因的序列设计引物（Tab.1),连续进行RT－PCR和PCR两次扩增。其中,原肠胚来源的第二次PCR产物经电泳鉴定（Fig.1)后,酶切、克隆入质粒、测序、将该片段所在的基因命名为Bblim基因,该自然称为Bblim同源框。根据Bblim基因同源框的核苷酸序列推导出其相应的氨基酸序列（Fig.2),与其它LIM类同源框基因进行比较（Fig.3)后,认为：Bblim基因可归入lim3类基因。比较胚胎发育各个不同时期第二次PCR产物的含量－即Bblim基因的转录（Fig.4),提示：该基因可能在受精后和原肠成形前后两个发育阶段起作用。此外,Bblim基因的同源域与海鞘Hrlim的同源域高度同源,表达模式也相似,提示,Bblim基因可能是Hrlim基因在文昌鱼中的类似物。     

青岛文昌鱼LIM类同源模型基因反义寡核苷酸对其胚胎发育的影响

研究了青岛文昌鱼ＬＩＭ类同源框基因Ｂｂｌｉｍ反义寡核苷酸对文昌鱼胚胎发育的影响。根据已克隆的Ｂｂｌｉｍ基因序列,设计并合成了对应于该基因同源框区的两条反义寡核苷酸链,用电脉冲方法将其导入文昌鱼受精卵。结果表明：反义寡核苷酸与随机序列寡核苷酸都不影响胚胎细胞分裂,而反义寡核苷酸能掏胚胎细胞Ｂｂｌｉｍ基因的表达。还发现只存在于导入反义寡核苷酸的幼体中的两种畸形－一是在幼体的腹侧近咽部有一圆形突起的结构     

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的组织特异性表达

为了探索文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶AdoHcyase基因在文昌鱼组织中的表达分布情况,利用组织原位杂交技术,以地高辛标记的反义RNA为探针,检测了文昌鱼AdoHcyase基因在组织中的表达分布特点.结果表明,AdoHcyase基因在雌性文昌鱼的卵巢、肝盲囊和后肠杂交信号十分强烈,在内柱、鳃等组织中也有微弱信号表达,...     

花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析

利用Protparam、iPSORT prediction、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling和Scan Prosite等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行分析。以花生粤油45总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆花生白藜芦醇合酶基因的DNA和cDNA序列,并利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其基因和蛋白质序列进行了分析。测序结果显示,该基因的DNA和cDNA序列长度分别为1 498 bp和1 251 bp,cDNA序列具有完整的开放性阅读框,编码389个氨基酸的多肽。该白藜芦醇合酶氨基酸368-378位点上存在芪合酶家族的特征位点GVLFGFGPGLT。同源性分析表明,其碱基序列与已报道的花生白藜芦醇合酶基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已报道的花生白藜芦醇合酶氨基酸序列的一致性为100%。     

异色瓢虫过氧化氢酶(Catalase)的基因克隆及序列分析

【目的】克隆异色瓢虫Harmonia axyridis保护酶系中过氧化氢酶(Catalase,CAT)的全长cDNA序列,并分析该基因的基本特性。【方法】采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫中克隆到HaraxCAT基因的cDNA全序列(GenBank登录号KC991026),并采用生物信息学的相关方法进行了分析。【结果】HaraxCAT的cDNA序列全长1 781 bp,其包含110 bp的3′非编码区域和45 bp的5′非编码区域,可读框长1 626 bp,编码541个氨基酸。预测该基因编码蛋白的分子量为61.55 ku,理论等电点为8.33,包含3个糖基化位点,无信号肽序列和跨膜结构。并且该基因包含了一个长达18个氨基酸的潜在的活性位点序列FDRERIPERVVHAKGAGA和血红素配体信号序列RIFSYGDTH。同源比对不同昆虫的CAT蛋白序列,发现昆虫CAT非常保守,HaraxCAT与其他昆虫的同源性高达65%及以上,与赤拟谷盗Tribolium castaneum同源性最高,达75.25%;系统发育分析表明其与鞘翅目赤拟谷盗和白星金花龟Protaetia brevitarsis亲缘关系最近。【结论】获得异色瓢虫catalase基因的cDNA全长序列,证实昆虫CAT蛋白非常保守。     

文蛤过氧化氢酶的生物信息学分析

基于NCBI数据库,对文蛤过氧化氢酶基因(MmeCAT)进行生物信息学分析,旨在为文蛤过氧化氢酶的结构与功能的研究提供理论基础。结果表明,该基因编码511个氨基酸。文蛤过氧化氢酶分子量为58 181.29 Da,分子式为C_(2588)H_(3928)O_(767)N_(730)S_(20),理论等电点为8.05,属亲水蛋白。带负电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)为63个,带正电荷氨基酸残基数(Arg+Lys)为65个。假设所有半胱氨酸全部形成胱氨酸,其消光系数为63 175 mol/L,相应的吸光度为1.086;假设所有的半胱氨酸均未形成胱氨酸时,消光系数为62 800 mol/L,相应的吸光度为1.079;其半衰期为30 h,脂肪族氨基酸指数为57.28,不稳定系数为27.77(40),可知文蛤过氧化氢酶为稳定蛋白质。亚细胞定位于过氧化物酶体,存在71个磷酸化位点和51个糖基化位点,无信号肽。二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,在物种进化上具有高度的保守性保守结构域预测表明,该基因编码蛋白可能属于典型单功能过氧化氢酶的第三分支。研究文蛤过氧化氢酶结构,能够为文蛤抗逆性品种选育提供理论基础。     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类,从400mmol/LNaCl处理的盐地碱蓬（Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2)。其中Sscatl(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架。而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段。据编码Sscatl3′端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性则为一个单拷贝基因。Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异;400mmol/LNaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscat1受盐诱导表达,不同盐处理时间下的表达分析也证实。在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达。这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的,生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高。     

葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及序列分析

目的:从葡萄中克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并对其序列进行生物信息学分析.方法:利用葡萄总RNA为模板,采用RT - PCR技术克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并亚克隆进T- Vector.利用生物信息学工具对其核酸和蛋白序列进行分析.结果:测序结果显示其cDNA序列全长为1 257bp,含有一个1 179bp的开放阅读框.生物信息学分析表明葡萄白藜芦醇合酶基因编码392个氨基酸,分子量为42.9kDa,理论等电点为5.97,具有芪合酶家族固有的氨基酸保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成.结论:该基因的克隆、生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础.     

雌雄文昌鱼同工酶的表型差异

本文应用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合生化染色方法分析了雌雄文昌鱼中苹果酸酶、苹果酸脱氢酶、酸性磷酸酶和酯酶四种同工酶的酶谱。首次发现苹果酸酶、苹果酸脱氢酶和酸性磷酸酶表型在文昌鱼雌性和雄性个体之间存在差异 ,而在同一性别不同个体之间无差异。酯酶表型较复杂 ,不但在不同性别个体之间而且在同一性别不同个体之间都出现一定差异     

Presence of prophenoloxidase in the humoral fluid of amphioxus Branchiostoma belcheri tsingtauense

The presence of phenoloxidase (PO) activity in the humoral fluid of amphioxus Branchiostoma belcheri tsingtauense was electrophoretically and spectrophotometrically studied. The enzyme was present in the humoral fluid predominantly as an inactive proenzyme, prophenoloxidase (proPO). The optimum temperature for activation of the proPO ranged from 30 degrees C to 35 degrees C, and the enzyme exhibited optimum activity at pH between 7.0 and 7.5. ProPO in the humoral fluid was readily activated to active form PO by exogenous elicitors such as trypsin, zymosan and LPS. The activation of the proPO by exogenous elicitors was significantly enhanced in the presence of 10 mM Ca2+, but was susceptible to serine protease inhibitors like soybean trypsin inhibitor and p-nitrophenyl-p'-guanidinobenzoate. PAGE revealed a single band of PO activity in the humoral fluid with an apparent molecular mass of 150 kDa, which was resolved to three bands with molecular masses of 44, 46 and 72 kDa, respectively, after SDS-PAGE. This is the first report on the presence of the enzyme PO in amphioxus humoral fluid.     

文昌鱼一个GATA基因在胚胎发育中的表达图式(英文)

GATA基因在脊椎动物和非脊椎动物的发育中行使重要的功能,该家族的成员在进化上也足非常保守的.脊椎动物的GATA基因分为两个亚群:GATA1/2/3和GATA4/5/6.通过生物信息分析,在文吕鱼的基因缓中找到了3个GATA基因:一个GATA1/2/3业家族基因,两个GATA4/5/6亚家族基因:还找到一个类GATA基因.还克隆了白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)GATA123的一段序列,并研究了它在早期胚胎发育中的表达图式.结果表明GATA123在原肠胚的中内胚层表达,而在神经胚晚期和幼体早期,GATA123在脑泡和消化道中部区域表达.这种表达模式与头部发育的重要基因Otx相类似.结果提示在文吕鱼脑泡的发育过程中GATA123和Otx很可能共同发挥着重要的作用.     

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因表达载体的构建及表达纯化

为了在原核细胞中表达青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtaunese S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adeno-sylhomocysteine hydrolase,SAHH),采取构建文昌鱼SAHH基因的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-SAHH的方法,转化入大肠杆菌JMl09感受态细胞中,IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化.结果经SDS-PAGE分析,重组质粒在JM109中表达并纯化得到的融合蛋白大约为70 kDa,成功构建了文昌鱼SAHH基因原核表达载体,且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白.     

文昌鱼秦皇岛、青岛和厦门地理种群形态特征的分化

把分别采自秦皇岛、青岛和厦门(各25尾)的文昌鱼种群的形态特征分为计数性状8个和计量性状10个,然后对18个形态特征进行ANOVA、聚类和主成分分析。结果表明:3地种群全长、体高和背腹鳍条数等18个形态特征的平均值均存在显著差异(P<0·05),且种群间的变异大于种群内。进一步比较秦皇岛和青岛种群,除在口笠触须、背鳍条数、腹鳍条数和肌节总数4个特征较为相似外,其余14个特征均存在显著差异(P<0·05);而青岛和厦门种群在全长、体高、腹孔肛门间肌节数、生殖腺数、吻鳍高、背鳍高、上尾鳍高等7个特征上更为相似(P>0·05);此外,秦皇岛和厦门种群在腹鳍高、上尾鳍长和高、下尾鳍长和高等5个特征上存在相似性(P>0·05)。聚类分析结果表明,75个样本明显分成两个类群:第二类群主要由厦门样本构成,而第一类群则主要由秦皇岛和青岛样本构成。由前3个主成分分析结果表明,所有样本可大致分为3个类群:秦皇岛、青岛和厦门类群。其中来自厦门的个体聚成一个明显的独立类群,而来自秦皇岛和青岛的样本在主成分分析图上则存在一定的交叉和重叠。总之,厦门地理种群分化最为明显,而秦皇岛和青岛种群在总体分化的趋势下,个体间形态特征仍存在相似性。     

白氏文昌鱼单个体基因组BAC文库的构建

隶属于头索动物亚门的文昌鱼是现存生物中最近似于脊椎动物亚门直接祖先的一个类群, 具有重要的进化地位, 是研究脊椎动物原始祖先的重要材料和模式动物。随着文昌鱼实验室连续繁殖的成功, 全基因组测序成为中国文昌鱼模式化急需完成的工作之一。文章从单条雄性白氏文昌鱼精巢组织中提取高质量的基因组DNA, 经EcoRⅠ限制性内切酶和EcoRⅠ甲基化酶酶切, 脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段, 连接线性磷酸化的载体pCC1BAC, 转化大肠杆菌EPI300 E. coli, 构建了含有44 706个克隆的全基因组BAC( Bacterial artificial chromosome)文库, 该文库平均插入片段80 kb,具有9倍的基因组覆盖率, 基本能够满足功能基因等研究需要, 为中国文昌鱼全基因组测序打下基础。     

青岛文昌鱼精子运动特征及计算机辅助分析

青岛文昌鱼的精子在精浆中不运动,在与精浆等渗的生理溶液中也不运动,把精液稀释到过滤海水或人工海水后,精子运动被激活。文昌鱼新鲜精液中精子浓度为(9.4±1.6)×1010/ml;在人工海水中,运动精子占总精子数的85.8%±6.9%,精子运动持续的平均时间是22.7±2.6min。文昌鱼精子经人工海水激活0.5min后,可观察到四种运动方式:(1)向前直线运动,其平均速度93.6±23.7μm/s,这类精子所占的百分比为27.8%±3.1%;(2)弧形曲线运动,平均速度55.6±18.9μm/s,所占的百分比为44.3%±2.5%;(3)左右摆动,平均前进速度27.4±13.4μm/s,所占百分比为14.7%±1.8%;(4)运动速度小于5μm/s的精子,视为不运动的精子,所占百分比为13.2%±1.8%。随着激活时间的延长,文昌鱼精子的运动状态发生改变,向前直线运动和弧形曲线运动的精子逐渐减少,而左右摆动和不运动的精子逐渐增多。