静原鸡ELOVL2基因多态性及其生物信息学分析

极长链脂肪酸延长酶(elongation of very-long-chain fatty acids, ELOVLs)是脂肪酸合成过程中的关键限速酶,在脂类的生物合成及脂肪酸代谢等调控方面作用显著。为研究宁夏地方优良品种静原鸡ELOVL2基因多态性及其编码蛋白质的结构与功能,以原鸡ELOVL2基因序列作为参考序列,针对ELOVL2基因的8个外显子序列设计特异引物并扩增,经DNA混合池测序筛选出存在突变位点的外显子序列,运用PCR-SSCP技术检测其多态性,经序列拼接后对ELOVL2 CDS区序列进行功能生物信息学分析。研究结果表明,静原鸡ELOVL2基因仅exon7和exon8发生单碱基突变(exon7为c.708 G>A, exon8为c.888 T>C),均未引起氨基酸的改变,属同义突变。在exon7和exon8扩增片段中分别检测出3种(AA, AG和GG)、2种(CC和TC)基因型。遗传特性分析显示,E2e7呈中度多态(0.250.05)。生物信息学分析表明,ELOVL2 CDS序列全长为894 bp,共编码297个氨基酸。其原子组成为C1638H2444N394O406S15,分子量为34.63 kD,等电点(pI)为9.40;存在7个跨膜结构,21个磷酸化位点,无信号肽序列,为稳定的水溶性蛋白;ELOVL2基因在进化中高度保守。该研究结果将为进一步研究ELOVL2基因在静原鸡肉质方面的作用及功能提供参考。     

基于转录组测序技术进行静原鸡差异miRNA与mRNA的关联分析

为探究静原鸡肌肉组织肌苷酸沉积过程的分子调控机制,本研究以静原鸡胸肌和腿肌组织作为试验材料,通过转录组测序技术,利用生物信息学分析方法筛选出差异表达miRNA及其靶基因.分析结果表明,静原鸡胸肌和腿肌组织的比较组合中有39个差异表达miRNAs(19个显著上调,20个显著下调).通过miRNA-mRNA互作网络分析可知...     

棉铃虫触角羧酸酯酶HaCXE6基因的克隆、序列分析与mRNA表达

为研究羧酸酯酶(carboxylesterase,COE)在棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)触角中的生理功能,采用RT-PCR、RACE方法从棉铃虫雄蛾触角中克隆得到一条COE基因全长序列(GenBank No.JX306730),命名为HaCXE6。HaCXE6基因读码框1 623 bp,编码540个氨基酸,预测蛋白质分子量61.02 ku,等电点8.06。氨基酸序列比对分析表明,HaCXE6与海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis触角羧酸酯酶CXE6一致性最高,为68%;棉铃虫不同功能羧酸酯酶聚类分析显示HaCXE6与气味降解酶CCE006a最相近。与其它昆虫触角羧酸酯酶多序列比对分析发现,HaCXE6具有酯酶活性必须的催化残基Ser199,Glu323,His434,也保持着α/β-酯酶家族的特征基序Gly-xSer-x-Gly。不同组织和发育时期该基因荧光定量PCR分析结果表明,HaCXE6在雌、雄蛾各个部位均有表达,雌蛾腹部与雄蛾足中表达量最高;卵至成虫各个时期均有表达,蛹中表达量最高。     

意大利工蜂不同发育时期抗氧化酶基因mRNA表达量的变化

超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）在清除工蜂体内自由基的过程中起着关键的作用, 其活性和基因表达量的高低与蜜蜂的寿命、 抗病力有直接的联系, 进而影响着蜂群的生产性能。本研究采用实时荧光定量PCR法研究意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica不同发育时期铜锌超氧化物歧化酶（copper zinc superoxide dismutase, CuZnSOD）、 锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, MnSOD）及过氧化氢酶（catalase, CAT）基因mRNA表达量的变化。实验分别在幼虫、 蛹、 成虫3个阶段5个时间点（产卵后5 d的幼虫, 产卵后14 d的蛹, 出房后1 d, 12 d, 32 d的成虫）取样。结果表明, 3个抗氧化酶基因在各个发育阶段均有表达, 其中CuZnSOD和MnSOD mRNA的表达量在幼虫到蛹期和出房后12-32 d两个阶段呈下降趋势, 而都以出房后1 d时表达量最大, 蛹期表达量最小, 且显著低于其他4个时期(P<0.05)。CuZnSOD基因 mRNA的表达量在成虫阶段的下降趋势不明显, MnSOD mRNA的表达量则显著下降(P<0.05); 而CAT基因的mRNA表达量以蛹期最低, 且其表达量随蜜蜂的生长发育稳定上升, 在出房后12 d和32 d时表达量显著高于其他3个时期。这些研究结果在分子水平上揭示了抗氧化酶基因在蜜蜂不同发育时期的作用。     

西花蓟马细胞色素P450基因cDNA片段克隆与mRNA表达分析

细胞色素P450介导的解毒作用增强是昆虫对杀虫剂产生抗性的重要机制。本文通过RT-PCR克隆了西花蓟马CYP4家族5个细胞色素P450基因c DNA片段。多重序列比对发现,这5个基因在氨基酸水平的一致性在40%-76%之间。采用实时荧光定量PCR对5个CYP4基因的mRNA表达水平的分析发现,阿维菌素抗性品系CYP4-1、CYP4-2和CYP4-5的表达水平分别是敏感品系的3.50、4.00和2.48倍,表明西花蓟马对阿维菌素的抗性可能与这3个CYP4基因的过量表达相关。     

荷花LEAFY基因的克隆及表达分析

LEAFY（LFY）基因是花分生组织形成的必需基因,在成花过程中发挥重要作用。本研究以荷花品种‘红霞满天’为材料,利用已经获得的荷花LFY基因片段,采用RT-PCR和RACE技术克隆得到荷花LFY基因cDNA序列,命名为NnLFY。NnLFY全长cDNA为1 494 bp,开放阅读框（ORF）为1 173 bp,编码390个氨基酸,预测其相对分子量为44 517.1 Da。与其他物种已知的LFY基因序列进行同源性对比分析并构建系统进化树,结果显示荷花LFY基因与甜瓜LFY基因的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,LFY基因在荷花幼叶期、花蕾期、盛花期的根、茎、叶、花中均有表达,其中,花蕾期各器官的表达量较高。     

不同启动子调控外源基因在斑玉蕈中的表达分析

启动子是控制基因转录的重要顺式元件,也是遗传转化实验中驱动外源基因表达的重要工具.在同一真菌中,不同启动子驱动外源基因表达水平可能存在明显差异.因此,选择合适的启动子是提高外源基因表达水平的关键.本研究分别应用花椰菜病毒35S RNA (cauliflower mosaic virus 35S RNA,CaMV35S)...     

不同发育阶段雄性小鼠睾丸组织mEppin基因mRNA的表达差异研究

目的实时荧光定量PCR检测雄性小鼠不同发育阶段睾丸组织中m Eppin基因的mRNA表达差异,为探究m Eppin基因表达与雄性生殖相关性提供生物学数据。方法分别选取胚胎期、50日龄、90日龄雄性ICR小鼠各6只,共18只,取各组小鼠睾丸组织提取总RNA,实时荧光定量PCR方法检测m Eppin基因mRNA表达水平。结果不同发育阶段小鼠睾丸m Eppin基因表达水平差异明显。胚胎组小鼠中没有检测到m Eppin基因mRNA表达,50日龄小鼠和90日龄小鼠中均检测到m Eppin基因mRNA有较高表达水平。其中,90日龄小鼠睾丸中m Eppin基因mRNA的相对表达水平是50日龄小鼠的2.65倍。结论本研究结果表明m Eppin基因mRNA的表达在小鼠睾丸组织中具阶段特异性。     

核桃JrCBF基因的克隆与表达和单核苷酸多态性分析

根据CBF基因氨基酸保守序列设计简并引物,运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆核桃JrCBF基因cDNA全长序列。用实时荧光定量PCR分析JrCBF基因在低温胁迫下的表达模式,并分析JrCBF基因的单核苷酸多态性。结果获得长度为879 bp的CBF基因cDNA全长序列,编码214个氨基酸,命名为JrCBF;低温能诱导JrCBF基因的表达,4℃处理2 h后表达量开始增加,8 h后达到最大值;自然越冬条件下,JrCBF基因在花芽中表达量呈现先上升后下降的趋势,在寒冬时期(1月份)表达量最高;单核苷酸多态性分析JrCBF基因序列中有28个SNPs位点和7个Indels标记,存在2个突变热点区;单倍型分析显示15份材料可分为9个单倍型,单倍型多样性为0.9238。本研究为通过基因工程手段培育抗寒核桃品种和分子标记辅助育种提供了帮助。     

红色原鸡外周血单个核细胞IFN-γ的诱导表达及其荧光定量PCR检测

为建立检测红色原鸡外周血单个核细胞(PBMC)中干扰素γ(IFN-γ)mRNA表达水平的方法,通过优化刀豆蛋白A(Con A)诱导PBMC表达IFN-γ的条件,采用RT-PCR方法以3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参扩增IFN-γ基因,插入克隆载体pMD18-T分别构建重组质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH,以其作为标准品采用SYBR Green I染料法建立荧光定量PCR检测方法,并将该方法应用于34只红色原鸡PBMC IFN-γ表达量的检测。结果发现,PBMC在20μg/mL Con A刺激培养12-25 h时IFN-γ处于高表达水平;标准品质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH分别在拷贝数6.72×102-6.72×109、3.94×102-3.94×109范围内与其对应的Ct值呈现良好的线性关系(R20.99),扩增产物的熔解曲线均只有特异的单峰,表明所用引物特异性强。在优化Con A诱导红色原鸡PBMC表达IFN-γ条件的基础上,建立了可用于定量检测红色原鸡PBMC IFN-γmRNA表达水平的荧光定量PCR方法。     

飞蝗可溶型海藻糖酶基因的序列分析及mRNA表达特性

海藻糖酶是海藻糖代谢过程中的一个关键酶, 在昆虫发育和能量调节中具有重要作用, 为进一步探讨海藻糖酶基因的功能, 本文分析了飞蝗Locusta migratoria一可溶型海藻糖酶基因的氨基酸序列并对其mRNA表达特性进行了研究。结果表明： 该海藻糖酶（TRE, GenBank登录号： FJ795020）不含有跨膜结构。系统进化树分析结果显示, 该酶与大豆蚜Aphis glycines、 豌豆蚜Acyrthosiphon pisum、 褐飞虱Nilaparvata lugens和灰飞虱Laodelphax striatella可溶型海藻糖酶具有较近的亲缘关系, 因此我们将该酶的基因命名为LmTre-1。对该基因在不同组织和发育时期表达量的荧光定量 PCR 分析表明： LmTre-1在卵发育前期、 中期的表达量都很低, 卵发育后期表达量显著提高; LmTre-1在5龄若虫和成虫被检测的组织部位中均有表达, 在体壁中的表达量最高, 其次是在脂肪体、 肌肉、 气管、 精巢及卵巢中; 5龄飞蝗刚蜕皮后LmTre-1在体壁中的表达量较高, 随着生长发育其表达量逐渐降低; LmTre-1在成虫发育期体壁中稳定高表达。LmTre-1的mRNA表达特性与几丁质合成酶1基因非常相似, 据此推测该基因可能与体壁几丁质的合成相关。本研究为深入探讨该基因的生理功能提供了重要的基础数据, 并为以海藻糖酶为杀虫靶标的农药筛选奠定实验基础。     

成年核移植山羊生长相关基因的表达分析

体细胞核移植过程有可能影响克隆动物生长相关基因尤其是印迹基因的表达水平。本研究运用同源引物 PCR 扩增、RACE 技术并结合同源克隆策略, 克隆了 7 个山羊生长相关基因包括 3 个印迹基因(H19、IGF2 和 IGF2R)和 4 个非印迹基因(IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR)的完全 CDS 或者部分 cDNA 序列, 经生物信息学技术确认后, 用荧光实时定量 PCR 对 8只成年克隆山羊中这些基因的表达水平进行分析, 结果表明 3 个印迹基因中 IGF2R 基因表达水平极显著高于对照组的自然繁殖山羊(P<0.01), 而 H19 和 IGF2 的表达则没有很大区别; 4 个非印迹基因中只有 IGF1R 的表达水平极显著高于对照组(P<0.01), IGF1、GHR 和 GHSR 的表达与对照组相似。表明即使在表型正常的成年克隆动物也存在一定的表观遗传异常。通过对获得完全 CDS 和 3′UTR 的 IGF2 基因经过生物信息学分析表明, 山羊 IGF2 基因包含一个 540 bp 的开放阅读框 (ORF)编码 179 个氨基酸。IGF2 基因 cDNA 序列和氨基酸序列以及其它基因部分序列比较分析表明, 山羊所有这些基因与绵羊的同源性要高于同牛的同源性。     

烟夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析

为了深入了解精氨酸激酶基因的作用和寻求害虫防治新的分子靶标, 本研究采用RT-PCR和RACE技术, 从烟夜蛾Helicoverpa assulta脂肪体中克隆了精氨酸激酶cDNA序列, 命名为HassAK（GenBank登录号: HQ336337）, 并采用荧光定量PCR测定了HassAK基因在不同发育阶段（4龄幼虫第1天到化蛹第1天）、 不同组织（头部、 中肠、 脂肪体、 体壁和腹足）和不同温度条件下的表达情况。测序和序列分析结果表明, HassAK基因阅读框架全长1 068 bp, 编码355个氨基酸残基, 预测蛋白质分子量和等电点分别为40.0 kD和5.76。氨基酸序列分析表明, 该序列具有精氨酸激酶典型的酶活性部位、 酶活性中心位点和能形成离子偶结构的保守区。序列比对结果表明, HassAK与其他昆虫AK的氨基酸序列具有70%以上的一致性。荧光定量分析结果显示, HassAK基因在幼虫头部、 中肠、 脂肪体、 体壁和腹足均可表达, 其中以腹足和中肠内的表达水平较高。时序表达分析表明, 预蛹期HassAK基因的表达量达到高峰。此外, 高温和低温均诱导HassAK基因的表达, 说明该基因可能参与昆虫抵御外界不良环境。     

草菇不同菌株木聚糖酶xyn基因的表达及其酶活性分析

木聚糖酶是半纤维素酶系的重要组成部分,能够分解水稻、小麦等农作物秸秆中的半纤维素。研究探讨木聚糖酶相关基因及其功能,为进一步探讨木聚糖酶与草菇生物转化率之间的关系提供理论依据。首先通过生物信息学手段构建了草菇2个木聚糖酶基因xyn1和xynII编码氨基酸序列的系统进化树,然后从生物转化率不同的草菇菌株分别提取各自的RNA,反转录为cDNA后,采用实时荧光定量PCR技术分析了xyn1和xynII基因的转录表达情况;最后应用DNS法对这些菌株中的木聚糖酶活性进行了测定。研究结果表明,xyn1编码的氨基酸序列与草腐菌相似性较高,而xynII编码的氨基酸序列与木腐菌遗传差异较小。在木聚糖酶活性测定和实时荧光定量PCR结果中,不同菌株的木聚糖酶活性趋势与xynII的转录表达趋势相似,均呈现依次递减。草菇的木聚糖酶活性与其生物转化率之间存在正相关性,推测草菇不同菌株木聚糖酶活性差异可能表现在转录水平上的差异。     

烟夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆、序列分析与表达

为探明谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）在昆虫嗅觉识别中的作用, 本研究采用RT-PCR和RACE方法, 从烟夜蛾Helicoverpa assulta（Guenée）雄虫触角中克隆获得了1个GSTs基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为EU289223）。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性比对和系统发育分析, 发现该蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员, 因此将该基因命名为HaGSTe1。同时从烟夜蛾基因组DNA中克隆获得了该基因序列, 发现序列中含有5个内含子, 长度分别为415,513,296,333和269 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对HaGSTe1在雌、 雄虫不同组织的表达进行了定性和定量分析, 结果显示, 该基因在雌、 雄虫的头部（去掉触角和喙）、触角、喙、胸、足、翅以及雌虫的腹部均有表达, 并且在雄虫触角中的表达量最高, 且显著高于雌虫触角, 这种表达情况提示其可能与触角中性信息素及其他外源物质的分解有关。     

苹果PDHB-1基因家族的鉴定与表达分析

丙酮酸脱氢酶E1组分β亚基-1 (pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta-1,PDHB-1)基因是编码丙酮酸脱氢酶复合物E1酶β亚基的基因,在果实酸度积累过程中具有重要作用。为了探究苹果(Malus domestica L.) PDHB-1家族的进化特征及其在不同酸含量苹果中的表达情况,本研究利用NCBI、Pfam等数据库和Clustal X、MEGA、TBtools等软件进行生物信息学分析,通过结合可滴定酸含量测定与实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,q RT-PCR)分析,获得该家族基因在‘艾斯达’和‘成纪1号’2个不同酸含量的苹果中的表达情况。PDHB-1家族主要定位于叶绿体、细胞质和线粒体中,α-螺旋和不规则卷曲是该家族二级结构形成的主要因素。组织特异性表达谱显示大部分成员的表达量在果实中高于其他组织。q RT-PCR结果表明,大部分成员其表达量变化趋势与可滴定酸含量变化趋势一致,在果皮中,有14个成员的表达水平在酸含量较高的‘艾斯达’苹果中显著高于酸含量较低的‘成纪1号’,其中M...     

Real-time PCR检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中Boule、Dazl基因mRNA表达

旨在探讨DAZ基因家族Dazl和Boule基因与犏牛雄性不育的关系.采用实时荧光定量PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中DAZ基因家族Boule和Dazl基因mRNA表达并进行分析.结果表明,Boule和Dazl熔解曲线扩增产物呈现单特异峰,具有较高的灵敏度和特异性;标准曲线显示Ct值与重组质粒浓度间线性关系良好,相关系数均大于0.999;mRNA表达分析显示,3种牛中Dazl基因在犏牛睾丸组织中表达量最低,其中黄牛与牦牛、黄牛与犏牛差异显著(P＜0.05),犏牛与牦牛差异不显著(P＞0.05);Boule基因在3种牛睾丸组织中的表达量显示,黄牛与牦牛差异不显著(P＞0.05),黄牛、牦牛与犏牛差异显著(P＜0.05).结果提示,Dazl和Boule基因可作为研究犏牛雄性不育的候选基因.     

衰老标记蛋白30 mRNA在癌细胞中的表达研究

目的:检测衰老标记蛋白(SMP)30 mRNA在不同癌细胞系中的表达情况,探讨其在不同细胞中的表达差异。方法:分别采用RT-PCR与荧光定量PCR检测SMP30 mRNA在正常肝细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞中的表达,并用SPSS13.0进行统计学分析。结果:SMP30 mRNA在所有被检测的细胞株中均有表达,在癌细胞中的相对表达量分别为肝癌细胞(0.926±0.340)、胃癌细胞(0.922±0.379)、乳腺癌细胞(0.614±0.356)、宫颈癌细胞(0.608±0.346),而在正常肝细胞中为0.175±0.158,显示SMP30 mRNA在癌细胞中的表达量较正常肝细胞中高(P0.05),且在肝癌细胞中的表达量比在其他癌细胞中更高。结论:SMP30 mRNA在癌细胞中的表达高于正常肝细胞,且在肝癌细胞中的表达高于其他癌细胞,具有临床应用价值。