巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达

目的：研究CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达。方法：以质粒pBS1761为模板扩增TAP-tag片段,PCR产物经纯化后克隆在真核表达载体pTRE2-hyg上。再以pUK-CPSF30k、73k、100k为模板扩增CPSF基因片段,将其克隆在质粒pTRE2-hyg-TAP-tag中TAP-tag片段的下游,并将重组质粒转化入细胞株Hela Tet-offS3细胞内。结果：细胞抽提液经SDS PAGE电泳后进行蛋白质印迹杂交,胶片上出现野生型的CPSF条带和分子量较大的滞后条带。后者经分子量与分子标记对照,确系重组体TAP-tag-CPSF所表达的蛋白条带。结论：重组质粒pTRE2hyg-TAP-tag-CPSF30k,73k,100k在Hela tet-offS3内完好表达。     

外源基因在叶绿体表达系统中高效表达研究进展

综述叶绿体表达系统的特点,转化方法,同质化研究及提高外源基因在叶绿体基因组中表达水平的研究状况。     

植物表达单克隆抗体的研究进展

单克隆抗体作为一种重要的药用蛋白,在疾病的预防、诊断、治疗和体外研究等方面有着广泛的应用.利用植物反应器替代传统表达体系生产单克隆抗体有着巨大的优势,而种子作为天然的蛋白质储藏器官有着诸多的优点.本文将通过对表达策略、内质网定向表达和糖基化等方面的研究进展进行阐述,分析目前存在的问题以及利用植物种子表达单克隆抗体的前景     

鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达

为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达, 并简化质粒DNA的制备过程, 本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造, 为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5￠-和3￠-调控区切出, 同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体, 构建成另一输卵管特异表达载体pOV2; 将鸡卵清蛋白基因5￠-调控区单独克隆入同样载体, 获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性, 将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5'-调控区的下游, 获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后, 经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测, 结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达, 而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达, 而且表达的重组酶能分泌到蛋清中, 雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用, 其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明, 鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点, 能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

枯草杆菌表达系统的研究进展

枯草杆菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性的良好的发酵基础,是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。本阐述枯草杆菌基因表达的一般特点、表达载体、表达类型以及分泌表达存在的问题。     

三种乳腺特异表达载体表达特性的比较

为了比较不同来源乳腺特异表达载体的表达特性 ,将人溶菌酶 (hLYZ)cDNA分别克隆入自行构建的p2 0 5C3载体和国外引进的pBJ41和pBC1载体。重组载体p2 0 5C3LYZ、pBJLYZ和pBCLYZ分别用 2 5kDaPEI包裹后 ,通过尾静脉途径注射哺乳期小鼠。注射后 72h采集乳样 ,经微球菌溶解实验证明 ,3组小鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为 87、69、60mg L ;从每组小鼠的 1 2种组织提取总RNA ,经Dotblotting检测证明 ,三种重组载体除在乳腺中表达外 ,p2 0 5C3LYZ还在小鼠的脾和肠、pBJLYZ在脾、pBCLYZ在脾和肾中具有一定的异位表达 ;在有hLYZmRNA转录的上述脏器中用微球菌溶解试验均可检测到hLYZ活性。这些实验结果表明 ,自行构建的乳腺特异表达载体的表达特性与从国外引进的表达载体无明显差别。     

2个表达单元间相互位置和转录方向对表达的影响

目的:研究质粒表达载体中2个表达单元间相互位置和转录方向关系对表达的影响,找出利于2个表达单元表达的优化的相互关系。方法:以全抗体为研究对象,构建了轻重链方向不同的2种相互关系的单质粒表达载体pIRESdhfrA和pIRESdhfrB,转染CHO-dhfr-细胞后,对瞬时表达水平进行了比较。以pIRESdhfrA和pIRESdhfrB为基础,构建了瞬时表达载体pIRESdhfrA-sv40ori和pIRESdhfrB-sv40ori,在COS-7细胞中进行了瞬时表达水平的比较。构建了基于CHO定点细胞系的稳定表达细胞株,对pIRESdhfrA和pIRESdhfrB进行稳定表达水平的比较。结果:在CHO-dhfr-的瞬时表达水平比较中,pIRESdhfrB转染的细胞表达水平是pIRESdhfrA转染细胞的2.18倍。与pIRESdhfrA-sv40ori在COS-7细胞的瞬时表达水平相比,pIRESdhfrB-sv40ori是其表达水平的2.3倍。pIRESdhfrB-FRT构建的CHO定点细胞平均表达水平是pIRESdhfrA-FRT构建的CHO定点细胞的11.6倍。结论:在构建的真核细胞质粒表达载体pIRESdhfr中,2个表达盒的启动子头-头转录方向关系比头-尾方向关系更利于重组蛋白的表达。     

汉滩病毒核蛋白羧基端多肽原核表达载体的构建及表达

本文为建立分型检测方法,探讨了汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白羧基端多肽的抗原性。首先,分别构建编码HTNV核蛋白及其羧基端多肽的原核表达载体pRSETA—S、pRSETA—S—C;然后,将其转化入表达菌BL21(DE3)pLySs诱导表达,采用SDS—PAGE、Westem—blot进行鉴定。我们成功构建了pRSET A—S及pRSETA—S—C原核表达载体。SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达,呈不溶状态,Westem—blot显现目的蛋白具有良好的抗原性。为大量制备分型用核蛋白多肽抗原创造了条件。     

微生物脂肪酶的重组表达

微生物脂肪酶在传统和新型工业催化领域中的应用越来越广泛与深入。作为脂肪酶规模化制备主要途径的高效重组表达,为脂肪酶催化剂的最终形成及工业催化奠定了坚实的技术基础。概述并讨论了微生物脂肪酶重组表达的最新策略和发展趋势,阐述密码子优化、融合共表达、杂合启动子、同源高效表达、细胞表面展示和表达文库的高通量筛选等技术特点及其表达应用现状,指出细胞表面展示表达和表达文库高通量筛选体系为脂肪酶重组表达注入强劲活力;在此基础上对几种代表性微生物脂肪酶的重组表达进展作一综述,为微生物脂肪酶的重组表达研究及工业生产提供借鉴。     

大黄鱼肝表达抗菌肽2基因的克隆和原核表达

抗菌肽是在多种细胞中表达具有抗菌活性的肽类物质的总称,在免疫反应中发挥着非常重要的作用.通过同源克隆法克隆到大黄鱼肝脏表达的抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide-2,LEAP-2)基因的完整开放阅读框(Opening Reading Frame,ORF).克隆到的大黄鱼LEAP-2全长2236 bp,包含外显子Ⅰ78 bp,内含子Ⅰ880 bp,外显子Ⅱ179 bp,内含子Ⅱ1044 bp,外显子Ⅲ55 bp,编码序列312 bp,编码103个氨基酸.推断的氨基酸序列羧基端区域存在高度保守的4 个半胱氨酸残基,符合LEAP-2超家族的结构特征.同源性对比后显示LEAP-2基因在进化上高度保守,大黄鱼LEAP-2推断的氨基酸序列与牙鲆、黄颡鱼、蓝色鲶鱼和斑点叉尾鮰等鱼类之间的同源性均在95%以上.将大黄鱼LEAP-2 cDNA连接到pET-32a(+),构建了重组表达质粒pET-32a-LEAP-2,将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0 mmol/L IPTG诱导表达,获得了大小约为27 kDa的重组蛋白,与预期的一致.     

HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达

本实验成功构建了HCV全长基因的真核表达载体pCI-HCVFL,转染HepG2细胞后经免疫荧光和免疫组化法分别检测到结构基因区(C)和非结构基因区(NS3)病毒蛋白的表达,该载体可用于建立HCV转基因细胞模型以及进一步开展有关HCV复制与表达的深入研究。     

苎麻纤维不同发育时期差异表达miRNAs的表达谱分析

miRNA在植物生长发育过程中起着重要的调控作用.本研究从苎麻纤维伸长期和胞壁加厚、端壁溶合期的中苎1号苎麻韧皮组织为材料的miRNA芯片中筛选出3个差异表达的miRNAs:miR1450、miR156h和miR172b1.利用半定量RT-PCR技术对3个差异表达miRNAs在4个苎麻纤维发育时期(苎麻纤维分生期,纤维伸长期,胞壁加厚端壁融合期和纤维成熟期)的韧皮组织以及花、叶、根和地下茎等组织和器官中的表达情况进行研究.结果表明供试的3个miRNA在苎麻纤维伸长期和胞壁加厚端壁融合期的表达量均为差异表达,进一步验证了芯片结果,其中mi1450在纤维成熟期表达量最高,在纤维伸长期的表达量最低;mi156h在花、地下茎、根和叶中的表达量显著高于4个苎麻纤维发育时期;mi172b1在纤维分生期的表达量最高,在花中的表达量最低.本研究建立了苎麻miRNA的茎环RT-PCR检测体系,为进一步研究miRNA在苎麻纤维发育过程中的作用奠定了基础.     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

鹿茸富脯氨酸多肽-APRP基因融合表达载体的构建及表达

目的:构建鹿茸富脯氨酸多肽(APRP)基因融合表达载体,并诱导表达融合蛋白GST-APRP。方法:以鹿茸顶端组织总c DNA为模板,PCR方法扩增目的片段,连接p MDTM18-T载体,转化E.coli DH5α进行TA克隆。酶切与测序鉴定合格后,将目的片段与p GEX-6P-1质粒连接,完成p GEX-6P-1-APRP融合表达载体的构建。利用原核表达系统进行初步诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳检测蛋白表达情况。结果:PCR成功扩增出目的基因片段,目的基因片段大小为216 bp。提取表达载体质粒经酶切及测序分析证实p GEX-6P-1-APRR融合表达载体构建成功。利用终浓度为0.5 m MIPTG诱导,融合蛋白成功表达,分子量为35 k Da。结论:目前利用基因工程技术获得特定的鹿茸多肽的报道很少。本研究结果表明,利用原核表达系统可在体外对鹿茸富脯氨酸多肽基因(APRP)进行融合表达,并且融合蛋白GST-APRP以可溶形式表达,有利于进一步研究APRP。这也为研究其他鹿茸多肽单体成分提供重要参考。     

中国株HIV-1核心蛋白真核表达载体的构建与表达

运用限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ对pKSGAG进行双酶切,获得HIV-lgag基因,并与真核表达载体pCI—neo连接,构建含有中国流行株HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI—neoGAG。经XbaⅠ／SalⅠ双酶切及测序鉴定证实,成功地构建了HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG。通过脂质体将pCI—neoGAG转染入p815细胞,G418筛选4周后,使用间接免疫荧光方法检测表达产物。结果表明所构建的HIV-1核心蛋白真核表达载体能在p815细胞中高效表达,为下一步进行HIV-1 DNA疫苗研究奠定了基础。     

信号肽及其在蛋白质表达中的应用

分子生物学研究已进入后基因组时代,其中心任务是更多地关注基因组表达的蛋白质的结构和功能。由于基因功能最终通过其表达产物——蛋白质来实现,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质上。另外,在菌株、培养和发酵等逐渐成熟的条件下,构建高效的表达载体以提高外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。随着研究的深入,发现信号肽对蛋白质的定位有着非常重要的作用,使得信号肽的研究不仅具有重要的理论意义,而且也具有潜在的应用价值。就信号肽的结构和功能,信号肽的捕获方法及其在原核表达系统和真核表达系统中表达外源蛋白质的应用做一些介绍。     

哺乳动物细胞表达系统及其研究进展

从表达载体、宿主细胞、表达系统的类型及选择等四个方面对哺乳动物细胞系统进行了综述。对相关的研究进展,如高效启动子的发现和改构、新型细胞株的建立及诱导表达调控系统亦作了简要介绍。通过这些阐述,期望能建立一个简洁而清晰的有关该表达系统的框架,对在实验中决定选取何种载体、细胞株或何种表达方式时能够有所提示。     

hCGβ真核表达载体的构建和瞬时表达筛选

为探讨人绒毛膜促性腺激素β亚基（hCGβ）基因避孕疫苗的可能性,利用DNA重组技术将hCGβ的基因片段连接到真核表达载体pCMV4上,酶切分析鉴定正确构建了质粒DNApCMV4-hCGβ,将质粒DNApCMV4-hCGβ通过脂质体转染的方法导入体外培养的Hela细胞,双抗夹心ELISA法检测质粒DNApCMV4-hCGβ在Hela细胞瞬时表达系统中特异性的表达了hCGβ。结果表明hCGβ表达含量24h为6.78ng/ml,48h为15.24ng/ml,说明在体外瞬时表达了特异性hCGβ的pCMV4-hCGβ真核表达载体能够作为DNA疫苗使用,为pCMV4-hCGβ质粒DNA免疫小鼠进行DNA避孕疫苗的研究奠定了基础。     

心脏特异表达基因ASBIO的克隆及表达

从人类心脏文库中成功克隆了一个新的含有锚蛋白重复序列及SOCS盒结构域蛋白（ Ankyrin repeat and SOCS box protein, ASB）的家族成员ASBIO。该基因定位于染色体7q36．1,开放阅读框包含1329个核苷酸,由7个锚蛋白重复序列和1个SOCS盒组成,编码452个氨基酸,分子量大约是49．5kD。物种间的进化型分析比较表明该基因是非常保守的,人的ASB10基因和小鼠的Asb10基因有84．8％的同源性。半定量RT-PCR实验结果证明Asb10基因在成年小鼠的心脏和肌肉组织中高表达,提示其可能与心脏和肌肉组织的发育有关。亚细胞定位显示ASB10蛋白在细胞质和细胞核均有表达,为进一步研究奠定了基础。