内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的研究

目的探讨内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵宿主植物盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的能力。方法接种内生B.svelezensis HBB5及B.subtilis ATCC 6633菌株(0.35×10~8 CFU/mL)至含盾叶薯蓣地下茎组织的液体培养基,32℃、165~185 r/min连续发酵108 h,检测发酵液细菌、pH、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、淀粉酶(α-amylase)及薯蓣皂苷元溶出率等指标。结果内生B.svelezensis HBB5菌株有较强的酸、碱耐受力[pH(4.8±0.2)~(8.4±0.2)],相比B.subtilis ATCC 6633[pH(5.2±0.2)~(8.7±0.2)]差异不明显;前者达峰值生长量(60×10~(8±2) CFU/mL)明显高于后者(32×10~(8±2) CFU/mL)。发酵36~60 h时,B.svelezensis HBB5、B.subtilis ATCC 6633菌株发酵液的淀粉、麦芽糖、葡萄糖浓度达峰值,分别为(37.41±3.12)、(27.83±2.14)ng/mL,(21.06±1.25)、(16.54±1.08)ng/mL,(54.33±3.12)、(36.65±2.10)ng/mL,前者均高于后者。同时,B.svelezensis HBB5菌株维持高的α-amylase酶活性及薯蓣皂苷元溶出率。结论内生B.svelezensis HBB5菌株拥有较强的耐酸碱、降解淀粉、提高薯蓣皂苷元溶出的能力,为工业生产薯蓣皂苷元提供了一个新的方法。     

与盾叶薯蓣细胞共生培养的内生真菌分离及其生物学特性

从盾叶薯蓣根状茎中分离到一株与盾叶薯蓣细胞共生培养的内生真菌（RE0105）。测定了该菌ITS1-5．8S rDNA—ITS2序列并构建了系统发育树,发现RE0105与Libertella属形成一个类群,具有较近亲缘关系。该真菌能产生与宿主植物相同的代谢产物——薯蓣皂苷元。对RE0105培养特性研究表明：富含有机营养的培养基有利于其生长;盾叶薯蓣细胞提取物可明显刺激其生长;20μmol／L生长素NAA和2,4-D能够促进RE0105的生长。200μmol／L细胞分裂素KT和BA对RE0105生长具有一定的促进作用,但与生长素相比,细胞分裂素对RE0105生长的刺激作用较小。蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖和NH4NO3是RE0105生长的良好C源和无机N源,但NH4Cl和（NH4）2SO4对该菌生长具有明显抑制作用,并且显著影响其形态特征。     

盾叶薯蓣试管株芽的诱导

以盾叶薯蓣(Dioscoreazingiberensis)试管植株为材料,选取带芽茎段为外植体,转接到株芽诱导培养基上15d后,原茎段基部开始产生株芽突起,30d后每一茎段可产生3-5个已生根的株芽,株芽诱导率为100%,株芽诱导数为180个/40株,其移栽成活率可达90%以上。株芽形成的适宜培养条件:温度为26±2℃,光照时间14hd-1,光照强度为1500-2000lx;适宜培养基组成为:MS+6-BA4.0mgL-1+IBA1.0mgL-1+蔗糖6%-9%+活性炭0.5%+琼脂7%。离体诱导的盾叶薯蓣试管株芽能直接发育为新植株,为盾叶薯蓣的快繁提供了一种新的方法。     

盾叶薯蓣研究进展

对国内盾叶薯蓣资源概况、分布范围、生态环境、化学成分、品种选育、组织和细胞培养等研究现状进行评述.盾叶薯蓣是我国特有的甾体激素类药源植物,也是世界上薯蓣皂甙元含量最高的资源植物,广泛分布于北亚热带及中亚热带地区.适宜生长区为陕西南部和湖北武当山区,在海拔400～700m、年平均温度16～18℃、年降水量800～900mm、相对强光913～1004μmol·m-2·s-1之间的山地棕壤和山地黄壤等腐殖质深厚的近酸性土壤中生长较为适宜;由于其长期对环境条件的适应,形成了分化显著的生态型,并且在形态特征与遗传特性等方面表现显著,据此已选育出多个栽培品种;组织培养技术是进行种苗生产、品种培育的有效途径,也是工业化皂甙生产的有效途径;薯蓣皂甙主要分布于根状茎中,根状茎主要由周皮、基本组织和散生在基本组织中的维管束三部分组成,周皮细胞的分裂和体积增大使根状茎迅速生长,薯蓣皂甙主要分布于基本组织薄壁细胞中;影响盾叶薯蓣皂甙含量的因素主要有分布区、海拔、土壤、水分、温度、光照等环境因子,也有株间差异、生长时间、生育期、开花时间、根状茎水分含量及形态等自身因子.     

盾叶薯蓣的快速繁殖

对盾叶薯蓣（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｚｉｎｇｉｂｅｒｅｎｓｉｓ Ｗｒｉｇｈｔ）的外植体进行组织培养,筛选到诱导芽和诱导根的优化培养基和培养条件,建立了无性快速繁殖培养系,获得完整的培养植株并移栽成功。并用分光光度法初步分析了该诱导植株生长根的薯蓣皂素含量。     

盾叶薯蓣的栽培技术研究

盾叶薯蓣是一种极具开发潜力的药物资源。从根茎繁殖 ,种子繁殖 ,田间管理 ,病虫害防治等几个方面详细总结了盾叶薯蓣的人工栽培技术。     

盾叶薯蓣营养器官薯蓣皂甙元含量的动态变化

利用高效液相色谱(HPLC)法对盾叶薯蓣营养器官特别造根状茎中薯蓣皂甙元含量的动态变化、品种之间的差异以及雌雄株之间的差异进行了研究。结果表明:实生苗根状茎中薯蓣皂甙元的含量,2年生高于1年生;根茎营养繁殖的2年生根状茎中皂甙元的含量高于1年生的含量;花叶品种的含量高于绿叶品种的含量;雄株的含量比雌株的含量高。在地上的缠绕茎和叶中没有检测到薯蓣皂甙元。由根茎繁殖的1年生根状茎前期皂甙元含量增加缓慢,后期增加较快;2年生根状茎盛花期含量最高,开花后期含量最低,随后含量逐渐增加。为此应在花叶品种中选择产量高、抗性强的品种作为栽培品种。合适的采挖期仍以地上缠绕茎枯萎期为宜。     

内生镰刀菌Dzf17多糖对盾叶薯蓣培养物薯蓣皂苷元积累的促进作用(英文)

从盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)内生镰刀菌(Fusarium oxysporum)Dzf17制备出胞外多糖(EPS)、菌丝水提多糖(WPS)和菌丝碱提多糖(SPS),研究了这3种多糖对盾叶薯蓣幼苗和细胞培养物薯蓣皂苷元积累的影响。3种多糖中,菌丝水提多糖对盾叶薯蓣幼苗和细胞培养物薯蓣皂苷元的积累有最明显的促进作用。向培养基中添加20 mg/L的菌丝水提多糖培养盾叶薯蓣幼苗和细胞,薯蓣皂苷元的产率分别为10.04 mg/L和2.40mg/L,是对照的3.11倍和3.87倍。结果表明,可以利用内生镰刀菌Dzf17多糖有效提高盾叶薯蓣培养物中薯蓣皂苷元的产量。     

盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元提取新工艺的研究

为研究新工艺提取盾叶薯蓣薯蓣中薯蓣皂甙元的最佳实验指标,以薯蓣皂甙元得率为评价参数,采用6因素5水平的正交实验,用分光光度法对25种提取方法所得到的薯蓣皂甙元进行比较分析。结果表明,硫酸浓度对薯蓣皂甙元提取的影响最大,在实验室条件下,可采用20g样品加甲醇回流提取4h,回流速度为10min／次,用2．5mol／L的硫酸水解6h,120号溶剂汽油回流提取2h,回流速度为15min／次,能清洁快速提取盾叶薯蓣中的薯蓣皂甙元。     

鲜盾叶薯蓣中原始皂甙的分离与鉴定

从盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis Wright)新鲜根茎的甲醇提取物分离到薯蓣皂甙元棕榈酸酯(diosgenin palmitate)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、纤细皂甙(gracillin)、原纤细皂甙(protogracillin)和原盾叶皂甙(protozingiberemissaponin),后者为一新甾体皂甙,结构推定为3-O-{α-L-鼠李吡喃糖(1→3)-[β-D-葡萄吡喃糖(1→2)]-β-D-葡萄吡喃糖}-26-O-{β-D-葡萄吡喃糖}-薯蓣皂甙元(3-O-{α-L-rhamnopyran0syl(1→3)-[β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranosyl}-26-O-{β-D-glucopyranosyl}-diosgenin)。     

Insertional mutagenesis of Aspergillus fumigatus

We have investigated transformation with heterologous DNA as a method for insertional mutagenesis of Aspergillus fumigatus. Two methods, polyethylene glycol-mediated transformation of protoplasts and electroporation of germinating spores, were used to establish conditions leading to single-copy integration of transforming DNA at different genomic sites. We have assessed the effect of restriction enzyme-mediated integration (REMI) for both methods. Non-REMI protoplast transformation led to integration of multiple copies of transforming DNA in the majority of transformants. Results of REMI with protoplast transformation varied depending on the enzyme used. Low concentrations of several restriction enzymes stimulated transformation, but of ten enzymes investigated only REMI with XhoI and KpnI resulted in single-copy integration of transforming DNA for the majority of transformants. For protoplast transformation with XhoI- or KpnI-based REMI, 50% and 76% of insertions, respectively, were due to integrations at a genomic enzyme site corresponding to the enzyme used for REMI. Electroporation of spores without addition of restriction enzyme resulted in a high transformation efficiency, with up to 67% of transformants containing a single copy of transforming DNA. In contrast to protoplast transformation, electroporation of spores in the presence of a restriction enzyme did not improve transformation efficiency or lead to insertion at genomic restriction sites. Southern analysis indicated that for both protoplast transformation with REMI using KpnI or XhoI and for electroporation of spores without addition of restriction enzymes, transforming DNA inserted at different genomic sites in a high proportion of transformants. Received: 6 March 1998 / Accepted: 25 May 1998     

不同倍性盾叶薯蓣的核型分析

采用根尖压片技术对盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)野生和栽培植株的染色体进行核型研究。结果表明,野生盾叶薯蓣为二倍体,其核型公式为2n=2x=20=14m+6sm。4个栽培植株均为四倍体,它们的核型公式分别为:株系A02-6为4x=40=20m+18sm+2st,株系A05-6为4x=40=16m+22sm+2st,株系A09-2-1为4x=40=18m+20sm+2st,株系‘红卫’为4x=16m+22sm+2st。不论是野生种还是栽培株系的核型类型均为2B型,且二倍体与四倍体间、四倍体的不同株系间的核型均存在较大差异。     

伊犁野生郁金香内生烟曲霉的分离鉴定及活性

【背景】对郁金香的研究主要集中在种质资源、引种栽培、扩繁育种及化学成分分析方面,而关于伊犁野生郁金香内生菌的研究尚未见报道。【目的】从伊犁野生郁金香中筛选出内生真菌并对其进行抑菌及抗氧化活性研究。【方法】采用组织块培养法和平板划线法对伊犁野生郁金香内生菌进行分离纯化;用斜面低温保存法对内生菌进行保存;以形态学方法和分子生物学方法对分离出的内生真菌进行鉴定;通过液体发酵得到次级代谢产物,对乙酸乙酯萃取发酵产物进行滤纸片抑菌分析。使用Fe3+总还原能力法、2-2′二苯基-1-三硝基苯肼(2,2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基法、 2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid,ABTS]自由基法及羟基自由基法比较菌株乙酸乙酯层和水层的抗氧化活性。【结果】从伊犁野生郁金香中分离获得一株内生真菌,经鉴定为曲霉属(Aspergillus)烟曲霉(Aspergillus fumigatus),简称为YGL-1。YGL-1对金黄色葡萄球菌(Staphylo...     

额外拷贝ERG6基因对烟曲霉的影响

通过构建烟曲霉ERG6基因额外拷贝株．研究该基因对烟曲霉生长速度、抗药物敏感性的影响。在烟曲霉基因组找出烟曲霉可能的ERG6基因的开放读码框(ORF),PCR扩增ERG6的ORF连同其上下游各约1 kb的DNA片段,利用DNA重组的方法将该片段克隆到载体pRG-AMA1-NotI。用重组后的质粒转化烟曲霉尿嘧啶营养缺陷株AF293．1。在MM和YAG培养基上观察转化子的生长速度。采用纸片扩散法和微量液基稀释法测定转化子对抗真菌药物敏感性。烟曲霉基因组中存在一个拷贝的ERG6基因,ORF大小为1,256 bp。其编码的蛋白与白念珠菌、酿酒酵母固醇甲基转移酶(Ers6p)的氨基酸相同率分别为57%和50%,相似率分别为70%和63%。烟曲霉中ERG6基因被成功克隆到了pRG-AMA1-Not I,产生了质粒pERG6。用pERG6和空载体pRG-AMA1-Not I转化AF293．1后,分别得到转化子AF-pERG6和AF-empty。AF-pERG6在MM和YAG培养基上的生长速度均比AF-empty慢。AF-pERG6和AF-empty对伊曲康唑、伏力康唑、特比萘芬、两性霉素B、卡泊芬净、灰黄霉素的敏感性没有差异。ERG6基因额外拷贝不影响烟曲霉对伊曲康唑、伏力康唑、特比萘芬、两性霉素B、卡泊芬净、灰黄霉素的敏感性,但是能使烟曲霉的生长速度减慢。     

盾叶薯蓣总皂苷超声提取及动力学

考察了乙醇体积分数、溶剂用量、超声时间、超声功率和超声频率对盾叶薯蓣总皂苷提取率的影响,研究了以体积分数70%乙醇溶液或水作溶剂从盾叶薯蓣中超声提取总皂苷的动力学模型。结果表明,在扩散过程中超声提取薯蓣总皂苷的动力学模型满足非定常扩散方程,相关系数为r=0.95,最佳超声时间为40min。     

盾叶薯蓣四倍体与二倍体叶表皮及气孔器显微结构的比较

对盾叶薯蓣四倍体和二倍体阴叶和阳叶表皮及气孔器的显微形态结构进行了比较。结果显示:叶片表皮细胞及气孔器的形态结构因染色体倍性及光照的不同而存在明显差异。表皮细胞有规则多边形与不规则细胞壁内褶2种类型;气孔器为典型的双子叶植物无规则型气孔器,仅分布在下表皮。四倍体表皮细胞密度、气孔器密度及气孔指数平均值分别为476.28±6.87个.mm-2、78.22±3.1个.mm-2、14.11,较二倍体的分别小4.60%、17.95%和11.98%。前者气孔器长、宽及保卫细胞宽度平均值分别为32.78±2.09μm、26.07±1.55μm、9.63±1.14μm,较后者的分别大10.73%、3.90%和18.01%,差异极显著。前者阴叶的较其阳叶的分别大5.77%、6.00%、8.72%;后者的则分别大1.72%、1.74%、2.41%。前者叶片保卫细胞中的叶绿体数目为23.93±3.19个,较后者的多74.00%。表皮细胞及气孔器密度、气孔指数,气孔器大小,保卫细胞叶绿体数目、尤其是保卫细胞宽度,可作为倍性鉴定的参考依据。四倍体高产有其良好的叶片结构基础。     

Toll样受体在烟曲霉侵染宿主细胞过程中作用的研究进展

烟曲霉侵染宿主细胞时伴有明显的细胞肌动蛋白骨架重排,而重要模式识别受体PRRs(pattern recognition receptors)之一,Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)参与调节病原细菌诱导的宿主细胞肌动蛋白骨架重排,其中TLR2和TLR4两亚型可以识别烟曲霉的病原相关分子模式PAMP(pathogen-assosiated molecular patterns),并诱发炎症因子表达等一系列效应信号,在宿主细胞抗烟曲霉天然免疫中发挥重要作用,但在烟曲霉内化侵入过程中TLR能否特异性介导细胞肌动蛋白骨架重排尚不清楚。因此,研究揭示TLR激活在烟曲霉侵入宿主细胞的调控作用,对寻找可能的抗真菌药物作用靶点具有重要意义。     

薯蓣内生真菌抗氧化活性的初步研究

用碘量法研究了4株薯蓣内生真菌的发酵液和菌丝的抗氧化活性。结果表明,4株菌株的菌丝和发酵液具有不同的抗氧化活性,其中从薯蓣块茎中分离得到菌株EDT5发酵液的抗氧化活性最强,从薯蓣种子中分离得到菌株EDS4发酵液的抗氧化活性次之,并且在一定范围内,随着发酵液粗提物浓度的增加,其抗氧化活性增强。EDT5和EDS4发酵液的抗氧化效果高于或近于其宿主薯蓣而高于维生素E的抗氧化效果,表明内生真菌是天然抗氧化产物开发的潜在重要资源之一。     

黑曲霉产木聚糖酶的分离纯化与鉴定研究

木聚糖酶的分离纯化是对其进行酶学研究和分子改良研究的基础。利用实验室选育的黑曲霉菌株Aspergillus niger SM24/a进行木聚糖酶发酵,粗酶液经过(NH_4)_2SO_4分级沉淀Bio-Gel P6除盐、UNO sphere Q阴离子交换和Enrich SEC70凝胶色谱层析四个步骤的分离纯化,成功获得了3种木聚糖酶蛋白定义为X-Ⅰ、X-Ⅱ和X-Ⅲ。随着纯化步骤的增加,各组分酶比活力得到显著提高,其数值分别为37.41、34.56和53.96 U/mg,纯化倍数分别为3.96、3.66和5.72。经质谱分析和蛋白氨基酸序列比对,初步认定X-Ⅰ属于糖基水解酶第十家族内切-β-1,4-木聚糖酶,X-Ⅱ和X-Ⅲ均属于糖基水解酶第十一家族木聚糖酶。