异源四倍体鲫鲤的受精细胞学

异源四倍体鲫鲤的成熟卵子处于第二次减数分裂中期,精子通过受精孔进入卵内.精子入卵以后,受精孔立即被受精塞堵住.受精后8 min,受精卵出现明显的精子星光,同时进入第二次减数分裂后期,即将排出第二极体;13 min时,精子头部开始膨胀,趋向核化;18 min时,雌雄原核均已形成,并向胚盘中央靠近;23 min时,雌、雄原核开始接触;33 min时,雌、雄原核完全融合成为一个合子核;38 min时,受精卵开始第一次卵裂,53 min后分裂形成两个子核.该研究证明异源四倍体鲫鲤和大多数二倍体鱼一样,具有正常的受精细胞学程序,受精方式为单精受精.     

用雄核发育方法制备改良异源四倍体鲫鲤群体

用UV照射金鱼的卵子使其卵核的遗传物质失活, 再与异源四倍体鲫鲤(AT)产生的二倍体精子受精, 在无雄核染色体加倍处理情况下, 成功地获得了两性可育的二倍体雄核发育鱼(A₀). Ⅱ龄性成熟的A₀自交形成了雄核发育鱼自交子一代(A₁). 本研究对10月龄A₁的染色体数目、性腺的显微和亚显微结构以及外型特征进行了观察, 实验结果表明: (ⅰ) A₁中包含有四倍体(A₁-4n)、三倍体(A₁-3n)以及二倍体后代(A₁-2n), 他们所占比例分别为85%, 10%和5%, 其染色体数目分别为4n=200, 3n=150和2n=100. 其中四倍体和三倍体的形成证明二倍体A₀能产生二倍体配子. 二倍体雄核发育鲫鲤杂交鱼产生二倍体配子的原因与早期生殖细胞的核内复制机制有关. (ⅱ) A₁-4n的性腺为两性型且发育正常. 其中雄性个体能挤出白色精液, 其中的二倍体精子头部明显比红鲫的单倍体精子头部大. 这些二倍体精子具有正常结构, 由头部和尾部组成, 头部与尾部交接处有多个线粒体, 精子尾巴的中央轴有典型的“9+2”微管结构. A₁-4n雌性个体的卵巢发育饱满, 其中含有大量Ⅱ, Ⅲ和Ⅳ时相的卵母细胞. 在Ⅳ时相卵母细胞的放射膜上能观察到受精孔. 同时期的A₁-2n, A₁-3n的性腺发育异常, 均表现为不育. A₁-2n的不育性与其为远源杂交二倍体有关, A₁-3n的不育性与其为远源杂交三倍体有关. (ⅲ) 与AT相比, A₁-4n不仅具有生长速度快、抗逆性强的优点, 而且在外型上具有体背高、尾柄短、头部小等优良性状. 本实验说明运用雄核发育技术不仅能获得两性可育的四倍体鱼, 而且能对异源四倍体鲫鲤进行有效的遗传改良, 这在细胞遗传研究和鱼类育种方面都具有重要意义.     

异源四倍体鲫鲤的性腺发育研究

采用组织切片技术对异源四倍体鲫鲤的性腺进行了研究。结果表明：异源四倍体鲫鲤的性腺发育程序和普通鲤鲫鱼相似,可以分为6个时期。雌雄个体都能达到性成熟,其中个体性成熟年龄为一周年;雄性个体比雌性个体成熟早,150日龄即可达到性成熟。成熟卵巢的成熟系数为9．25％－15．60％,成熟精巢的成熟系数为1．65％－5．19％。成熟期卵径为1670．4－1780．5μm之间,成熟精子头径为2．3－2．4μm。繁殖期为每年3－5月份。该研究证明异源四倍体鲫鲤的性腺发育是正常的,雌雄个体都能达到性成熟。     

转基因异源四倍体鲫鲤F1的研究

采用显微注射法将含有鲁鱼β－actin基因启动子的草鱼生长激素基因“全鱼”基因pCAgcGHc转入异源四倍体鲫鲤,然后使其自交得到转基因异源四倍体鲫鲤F1,对150日龄F1体重和体长进行检测,可明显看见转基因异源四倍体鲫鲤F1的生长优势;取F120尾,提取尾鲤基因组DNA,采用合适的引物,PCR方法检测转基因异源四倍体鲫鲤F1是否含有外源生长激素基因,结果150日龄F1阳性率达到90％,且有些雄性个体可以挤出少量精液,而普通150日龄异源四倍体鲫鲤无此现象,文章阐明了通过近交筛选转基因异源四倍体鲫鲤种系具有重要意义。     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的微卫星标记分析

采用从鲤中分离出来的32对微卫星DNA标记,对异源四倍体鲫鲤、红鲫和野鲤的基因组DNA进行了研究。在筛选出的15对微卫星引物中,随引物不同,各等位基因数为1～8个,大小在100～420bp之间。从3个不同群体内部的遗传相似系数来看,异源四倍体鲫鲤个体之间的遗传相似系数最大,说明异源四倍体鲫鲤群体内部的遗传变异程度最低,已经形成了一个遗传性状稳定的群体。从3个不同群体之间的遗传相似系数来看,异源四倍体鲫鲤和红鲫遗传相似系数为0．5625,和野鲤的遗传相似系数为0．5125,说明异源四倍体鲫鲤接受原始母本的遗传物质比原始父本野鲤要多一些。微卫星标记与以前报道的RAPD标记的检测结果是相似的,然而由微卫星标记获得的种群内和种群间的遗传距离均大于RAPD,说明微卫星标记比RAPD标记显示出更高的个体多态性。     

异源四倍体鲫鲤雌雄差异的RAPD标记

异源四倍体鲫鲤是从红鲫和湘江野鲤的杂交后代选育出来的,已经形成了一个遗传性状稳定的四倍体鱼新种群。用异源四倍体鲫鲤(雄性)和二倍体白鲫(雌性)生产的三倍体湘云鲫已经在全国推广应用。因此,如果能够了解异源四倍体鲫鲤的性别分化机制,人为地控制异源四倍体鲫鲤的性别分化,生产出大量的超雄鱼,这对于三倍体湘云鲫的产业化生产有重要的意义。刘少军等对异源四倍体鲫鲤的染色体组型进行了分析,并没有发现异源四倍体鲫鲤有明显的特化的性染色体,这说明通过细胞遗传学研究异源四倍体鲫鲤的性别遗传机制是有困难的。       

异源四倍体鲫鲤群体遗传多样性的RAPD分析

湖南师范大学和湘阴县东湖渔场合作,经过10多年的研究,获得了两性可育的异源四倍体鲫鲤群体1—7,目前已经繁殖到了F14。异源四倍体鲫鲤具有4套染色体(4n=200),它们的遗传多样性水平怎么样?这是关系到异源四倍体鲫鲤这一新的种质资源能否生存和进化的问题,有必要从分子水平进行深入的研究。随机扩增多态DNA(Random Am-plified Polymorphic DNA,RAPD)是建立在PCR基础之上的一种DNA分子标记技术8,具有简便、快速、实验成本低等特点,因此被广泛应用于物种的遗传多样性分析、亲缘关系的探讨和系统进化等方面的研究9—15。本研究采用RAPD技术,检测了异源四倍体鲫鲤群体的遗传多样性水平,以期为异源四倍体鲫鲤的人工繁殖、种群复壮以及种质资源保护提供DNA水平上的依据。       

异源四倍体鲫鲤雌核发育后代及其亲本RAPD分析

异源四倍体鲫鲤是湖南师范大学鱼类发育生物学实验室和湖南湘阴县东湖渔场在红鲫(♀)和湘江野鲤(♂)的杂交后代中选育出来的四倍体鱼,目前已连续繁殖14代(F3-F16),已形成一个四倍体性能代代相传、遗传性状稳定的四倍体鱼群体,这是世界上唯一人工培育的两性可育的异源四倍体鱼[1—2]。利用四倍体鱼与二倍体白鲫、二倍体鲤鱼杂交,可获得生长快、肉质鲜美、抗病力强等优良性状的不育三倍体湘云鲫、三倍体湘云鲤[3],并已在全国28个省市推广养殖,取得了显著的经济和社会效益。异源四倍体鲫鲤雌性个体产生的二倍体卵子具有两套染色体,在没有染色…     

异源四倍体鲫鲤雌核发育后代的RAPD分析

在优化RAPD(随机扩增多态性DNA)检测条件基础上,从134个随机引物中筛选出53个扩增较好且多态性强的引物,对异源四倍体鲫鲤第1代(G1)、第2代(G2)人工诱导的雌核发育二倍体后代群体的DNA多态性及分子标记进行了分析。结果显示,53个随机引物在G1群体和G2群体中检测到的位点数分别为541、511,其中多态性位点数分别为70、52,多态位点比例分别为12.94%、10.18%。两个群体的平均遗传距离分别为0.0732、0.0464。研究表明,经过连续2代人工雌核发育,G2的遗传多样性明显减少,种质进一步纯化。还从53个随机引物的扩增谱带中找到了2个引物(S50、S223)的特异扩增谱带,可以作为第1、2代雌核发育群体间的分子遗传标记。由计算机软件程序构建的分支系统树清晰地反映了两个雌核发育群体及其个体间的相互关系。       

三倍体鲫鱼--异源四倍体鲫鲤(♂)×金鱼(♀)

利用雄性四倍体鲫鲤与雌性二倍体红色双尾金鱼交配 ,制备了 1种新型三倍体鲫鱼 ,并对Ⅰ龄三倍体鲫鱼染色体数目和组型、性腺指数和性腺结构、外形、生长速度等生物学特征进行了系统研究。结果表明 :这种三倍体鲫鱼染色体数目为 3n =15 0 ,核型公式为 33m 5 1sm 33st 33t;在繁殖季节 ,三倍体鲫鱼卵巢和精巢指数明显低于作为对照的红鲫卵巢和精巢指数 ;组织学切片表明三倍体鲫鱼的卵巢和精巢不能产生成熟的卵子和精子 ,证明它们是不育的。三倍体鲫鱼体色为青灰色 ,单尾 ,具有一些介于其父母本———异源四倍体鲫鲤和红色双尾金鱼之间的外形特征 ,如具有 1对肉眼不易观察到的短须 ,侧线鳞式为 31 6 7,背鳍为 18,体高 体长之比为 0 5 ,比湘云鲫的体高 体长之比 (0 4 1)有明显的增加。经过约 8个月的饲养 ,该三倍体鲫鱼平均重量为 35 0g,最大个体达 5 5 0g。在Ⅰ龄鱼中 ,雌性三倍体鲫鱼的个体生长速度快于雄性个体。与三倍体湘云鲫相比 ,该三倍体鲫鱼保留了生长速度快、不育等优点 ,同时新添了体高 体长比值更高、肉质更甜美的特点 ,为 1种有推广前途的新型三倍体鲫鱼     

红鲫与湘江野鲤杂交的受精细胞学研究

红鲫成熟卵直径680—720μm;卵膜孔为精子入卵的唯一通道,包括前庭和精孔管两部分;精孔管内径约5μm。湘江野鲤精子头部直径约2.5μm。在通常情况下,红鲫卵为单精受精。尽管红鲫与湘江野鲤不同属,但杂交仍具有正常的受精细胞学程序。红鲫卵子处于第二次成熟分裂中期接受湘江野鲤精子入卵,精子入卵5min后,出现明显的精子星光;15min后,雄性原核及雌性原核形成;25min后,雌、雄性原核融合;30min后、开始卵裂,发现1个受精卵切片上有4个即将融合的原核,这可能是由于双精受精所致。     

异源四倍体鲫鲤及其原始父母本细胞周期蛋白B基因克隆与分子遗传分析

细胞周期蛋白(cyclin)B是真核细胞周期运转中调控G2期至M期转化的关键因子.本实验根据斑马鱼细胞周期蛋白 B1基因的剪切方式,设计3对特异于金鱼和银鲫细胞周期蛋白B基因外显子区兼并引物,首次扩增出异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼细胞周期蛋白B基因2条大小分别约为2.4 kb和2.1 kb的片段.测序及比对分析表明：这3种鱼的细胞周期蛋白B基因2个片段均包含8个外显子和7个内含子.内含子剪切位点符合GT/AG规则,推测细胞周期蛋白B基因2个片段可能是细胞周期蛋白B基因的2种存在形式.异源四倍体鲫鲤与其原始父母本细胞周期蛋白B基因片段序列的比较结果表明：无论是外显子区还是内含子区,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本都具有较高的遗传相似性,在1 025 bp的外显子序列中相同的碱基位点数达963个,为异源四倍体鲫鲤来源于红鲫和鲤鱼提供了分子证据;同时,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本差异碱基位点的存在又表明这一独特的多倍体物种与其原始亲本存在着进化上的变异.此外,还分别以细胞周期蛋白B基因外显子和内含子序列构建了包括异源四倍体鲫鲤及其原始父母本在内的系统进化树.结果初步表明：对于亲缘关系较近的物种,用外显子和内含子序列构建的系统进化树与传统的物种进化树一致;而对于亲缘关系较远的物种,用内含子序列构建的进化树与传统的物种进化顺序存在较大差异.     

异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们父母本线粒体DNA 12S rRNA基因遗传变异的分析

采用质粒克隆测序方法,获得了异源四倍体鲫鲤5个个体、异源四倍体鲫鲤雌核发育二倍体后代2个个体、三倍体湘云鲫2个个体及红鲫、湘江野鲤和日本白鲫各1个个体的线粒体DNA 12S rRNA基因的全序列。经对比发现,异源四倍体5个个体共享2种单元型,异源四倍体鲫鲤雌核发育二倍体后代2个个体、三倍体湘云鲫2个个体以及红鲫、湘江野鲤和日本白鲫各1个个体分别共享1种单元型。用MEGA 1.0 软件分析了它们的碱基组成和核苷酸序列差异,用邻接法构建系统进化树。它们间的序列同源性在95%~99%之间,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们母本（分别为红鲫和日本白鲫）之间的序列同源性大于异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们父本（分别为湘江野鲤和异源四倍体鲫鲤）之间的序列同源性,结果表明：异源四倍体鲫鲤和三倍体湘云鲫在线粒体DNA 12S rRNA基因上具有母性遗传特征。本研究另一值得注意地方的是异源四倍体鲫鲤经过9代(F3-F11)繁殖后,在5个个体中发现了2种单元型,说明在四倍体基因库中存在遗传多样性,为四倍体基因库的繁殖、保护和种群复壮提供了一些有价值的信息。     

转青鱼生长激素基因异源四倍体鲫鲤

生态安全性是转基因鱼走向市场的瓶颈,通过转基因四倍体鱼同转基因二倍体鱼杂交获得不育的转基因三倍体鱼是解决该问题的有效途径之一.本研究构建了青鱼β-actin基因启动子和青鱼生长激素（GH）基因精确连接的＂全鱼＂基因pbcAbcGHc;并采用显微注射法将pbcAbcGHc导入异源四倍体鲫鲤受精卵.对照养殖结果表明,150日龄的转基因异源四倍体鲫鲤原代（P0）的体重及体长明显大于对照组.选择60尾P0代转基因异源四倍体鲫鲤,采用PCR方法检测出外源青鱼GH基因在P0代转基因四倍体尾鳍基因组DNA中的整合率为90%;对20尾雄性P0代转基因四倍体精液样本的PCR检测发现,13个样本具有外源青鱼GH基因的整合.在一尾生长速度显著的P0代转基因四倍体鲫鲤的肌肉、肝脏、肾脏和卵巢组织中可检测到外源青鱼GH基因的转录.本研究成功获得了具有明显生长优势的P0代转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤,为建立转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤纯系和研制不育的转基因三倍体鱼奠定了基础.     

二倍体雌核发育鱼产生二倍体卵子的证据

二倍体雌核发育第 1代 (G1)产生的二倍体卵子经紫外线灭活的散鳞镜鲤精子诱导 ,无需染色体加倍处理 ,发育成二倍体雌核发育第 2代 (G2 ) ;G1 产生的二倍体卵子与雄性异源四倍体鲫鲤 (AT)产生的二倍体精子结合 ,形成新型两性可育的异源四倍体鲫鲤 (G1 ×AT)。对G2 和新四倍体 (G1 ×AT)的体细胞染色体数目、生殖细胞染色体行为及性腺结构、外形、生长速度等生物学特征进行了研究。结果表明 :G2 体细胞染色体数目为 2n =1 0 0。在 6～ 1 2月龄G2 中 ,没有发现性成熟的个体 ,组织学切片结果表明 ,G2 性腺处于卵原细胞增殖阶段 ,与 1龄G1 的性腺发育相似 ,性腺发育迟缓。对 6～ 8个月龄G2 性腺染色体制片进行观察 ,结果表明 ,G2 生殖细胞的染色体没有二价体的形成 ,只有有丝分裂的迹象 ,其有丝分裂中期不但有 2n =1 0 0的染色体分裂相 ,还有 4n =2 0 0的染色体分裂相 ,甚至有接近 8n(380 )的分裂相 ,说明 1龄G2 的性腺中存在 2n、4n等多种类型的生殖细胞 ,其中 4n的生殖细胞经正常的减数分裂后可产生二倍体卵子。核内复制 (pre meioticendoreduplication)学说可以较好地解释这种不减半配子产生的现象。新四倍体 (G1 ×AT)体细胞染色体数目为 4n =2 0 0 ,雌雄新四倍体 (G1 ×AT)具有正常的性腺发育 ,在繁殖季     

人工诱导异源四倍体,新四倍体及异源三倍体白鲫的细胞遗传学研究

作者比较了第一代异源四倍体鱼、异源三倍体鱼、新四倍体鱼与亲本白鲫、红鲫及其杂交一代的染色体组型。三种亲本的二倍体染色体数均为100,但其组型分组各有差异,白鲫染色体组型公式：12m＋36sm＋32st十20t,NF＝148,在亚中着丝点组中有一对特大的标记染色体;红鲫染色体组型：20m＋34sm＋26st＋20t,NF＝154;白鲫×红鲫杂种染色体组型：16m＋35sm＋29st＋20t,NF＝151,有一条与白鲫相似的特大标记染色体,证实其组型由白鲫和红鲫各提供一套染色体组组成。异源三倍体的染色体数为150,是亲本的1.5倍,染色体组型是：22m＋53sm＋45st＋30t,NF＝225,在亚中着丝点组中有一对特大标记染色体,表明异源三倍体的染色体组型含有两套白鲫染色体组和一套红鲫染色体组。第一代异源四倍体和新四倍体鱼染色体数目为其亲本的2倍,4n＝200。前者的染色体组型为：32m＋70sm＋58st＋40t,NF＝302,一对与白鲫相似的特大标记染色体明显可见,证明其染色体组型由白鲫和红鲫各提供两套染色体组。新四倍体的染色体组组型为：28m＋71sm＋61st＋40t,NF＝299,分裂相中三条特大的标记染色体较明显,推测其染色体组型由三套白鲫染色体组和一套红鲫染色体组组成。结果表明：第一代异源四倍体、异源三倍体和新四倍体与三种亲本的     

异源四倍体鲫鲤F9～F11染色体和性腺观察

采用肾细胞染色体制片技术,检测了异源四倍体鲫鲤F9-F11代的染色体数目及组型,结果表明：其染色体数目为4n=200,核型公式为44m 68sm 44st 44t,证明F9—F11继续保持四倍体性。观察异源四倍体鲫鲤F9—F11成熟性腺,在这3代四倍体鱼中仍然保持正常卵巢和精巢,分别形成正常二倍体卵子和二倍体精于。在自然环境下,观察了异源四倍体鲫鲤自行产卵受精井产生存活后代过程,证明该四倍体鱼群体在自然环境下能够自行繁殖传代。异源四倍体鲫鲤稳定的染色体数目和正常的性腺结构以及自然条件下的生殖传代行为,说明该异源四倍体鲫鲤已成为一个染色体数目为4n＝200、遗传性状稳定的新型四倍体鱼群体,具备形成新种所需的关键因素。     

异源四倍体银鲫外周血和精巢的组织学特征

通过比较D 系三倍体银鲫 (Carassius auratus gibelio Bloch) 与异源四倍体银鲫, 我们发现异源四倍体的外周血与精巢组织跟三倍体银鲫存在明显差异。HE 染色结果表明, 异源四倍体银鲫外周血红细胞有明显的分裂倾向。利用流式细胞术对D 系三倍体银鲫与异源四倍体银鲫外周血的DNA 直方图进行比较, 结果表明异源四倍体外周血的DNA 直方图有两个主峰。此外, 我们观察到异源四倍体银鲫精巢的三种类型, 其中Ⅰ型精巢可以产生正常精子, Ⅱ型可观察到精小囊结构, 但不能产生精子, Ⅲ型精巢未发育出精小囊结构。进一步用银鲫Vasa 抗体对精巢切片进行组织免疫荧光共聚焦显微分析, 结果表明, Ⅰ型精巢的生殖细胞完成了减数分裂, 能观察到精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞, 以及大量位于精小管中间的精子细胞和精子; 而Ⅱ型精巢的生殖细胞不能完成第二次减数分裂, 精小囊中存在大量的初级和次级精母细胞, 没有精子细胞产生。研究丰富了对异源四倍体银鲫生物学性状的认识。       

三角鲂（Megalobrama terminalis）精子与青鱼（Mylopharyngodon piceus）卵子的受精细胞学研究

以青鱼(Mylopharyngodon piccus)为母本和三角鲂(Megalobrama terminalis)为父本的杂交虽是不同亚科的远缘杂交,但有正常的受精细胞学程序和常规的细胞分裂(卵裂)方式。这些实验结果,为开展鱼类远缘杂交提供了受精生物学的理论基础;同时还证实鱼类远缘杂交的异种精子不仅有激活卵子的作用,而且参与了遗传物质的组成,使父本的性状能够在杂种后代表现出来。实践证明,鱼类遗传育种可以通过远缘杂交的途径获得杂种优势。青鲂杂种一代既具有母本青鱼的性状,也兼有父本三角鲂的特征,通过养殖试验已在渔业生产中取得成效(拟另文发表)。