茶树CsLEA5基因的克隆及表达分析

该研究以茶树‘龙井长叶’为材料,克隆获得了茶树胚胎发育晚期丰富蛋白基因CsLEA5的cDNA序列,该序列全长515 bp,包含一个375 bp的开放阅读框,编码124个氨基酸,预测蛋白分子量为13.5 kD,理论等电点为5.92。蛋白序列分析结果显示,CsLEA5为高亲水性和稳定性蛋白,且含有一个典型的LEA_3保守结构域,属于LEA蛋白中LEA_3亚家族成员。CsLEA5基因启动子区域包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件,如乙烯响应元件（ERE）、胁迫响应元件（STRE）、创伤响应元件（WUN motif）及MYB、MYC转录因子识别位点等。qRT PCR分析显示,CsLEA5基因表达具有明显的组织特异性,在叶片中的表达量最高,其次是嫩茎,而在其他组织器官中的表达量较低,且CsLEA5基因表达受低温和干旱胁迫的诱导。研究表明,CsLEA5基因可能在茶树响应低温和干旱胁迫过程中发挥重要作用。该研究对了解茶树抗逆分子机制,筛选抗性候选基因资源提供了重要理论依据。     

藜麦CqSAP8基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

该研究根据NCBI公布的藜麦胁迫相关蛋白(SAP)基因CqSAP8序列进行克隆,利用生物信息学分析CqSAP8蛋白序列、理化性质和结构特点,并采用qRT PCR方法检测CqSAP8基因表达的组织特异性及在非生物胁迫下的相对表达。结果表明：(1)藜麦CqSAP8基因CDS全长528 bp,编码175个氨基酸;预测CqSAP8蛋白分子量为18.73 kD,理论等电点为7.46,属于稳定的亲水性蛋白质;CqSAP8蛋白在N端和C端分别含有A20和AN1保守域,是SAP蛋白最典型的类型。(2)序列比对与进化分析显示,藜麦CqSAP8与甜菜BvSAP8、菠菜SoSAP8亲缘关系最近,序列相似性分别为89.66%和89.47%。(3)qRT PCR分析表明,藜麦CqSAP8基因在根、茎、叶、花和种子中均有表达,且在种子中表达量最高;CqSAP8基因在干旱和高温胁迫12 h表达量达到最大值,分别是对照的13.09和17.47倍,高盐和低温胁迫下的最大表达量均为对照的3.91倍,说明藜麦CqSAP8基因响应多种非生物胁迫应答;另外,藜麦CqSAP8的表达量在ABA胁迫下24 h急剧升高,推测CqSAP8基因在非生物胁迫前期的响应不依赖ABA。该研究为进一步研究CqSAP8基因功能及抗逆分子机制奠定了基础。     

蓖麻RcMsc2基因功能分析

G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白 2(G2/mitotic-specific cyclin-2,Msc2)作为高等植物应对逆境胁迫的关键调控蛋白,参与多个抗逆境胁迫的应答。为探究RcMsc2基因的功能,该研究从蓖麻叶片组织中成功克隆了RcMsc2,并利用生物信息学分析RcMsc2蛋白的结构和潜在功能,同时借助qRT-PCR方法分析RcMsc2基因的组织表达特性和非生物胁迫表达特性。结果表明:(1)RcMsc2基因位于蓖麻第5号染色体长臂,该基因的CDS(coding sequence)区是1 299 bp,编码432个氨基酸。(2)RcMsc2蛋白拥有细胞周期(cyclin)家族特征结构域,是一个不稳定酸性亲水蛋白,无跨膜域和信号肽,相对分子量为49.38 kD。(3)RcMsc2蛋白质的二级、三级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。(4)RcMsc2蛋白与麻风树和巴西橡胶树的CYCB2蛋白的序列同源性最高,且同被聚为Group Ⅱ。(5)35S-RcMsc2-GFP融合蛋白定位于细胞核。(6)RcMsc2基因在蓖麻的所有组织中均有表达且主要在根和茎中发挥作用; 非生物胁迫分析表明RcMsc2基因可以被脱落酸(abscisic acid, ABA)、盐、干旱和低温处理诱导表达,并且RcMsc2基因对低温胁迫的响应最敏感。综上表明,该研究较全面地分析了RcMsc2基因的结构特征、系统进化和表达模式,为揭示RcMsc2基因在蓖麻的生长发育和应答冷胁迫过程中的功能提供了理论参考。     

香菜CsEF 1α基因克隆与表达分析

翻译延伸因子EF 1α(elongation factor 1 alpha)是细胞中最丰富的蛋白质之一,其在确保mRNA正确解码以产生细胞蛋白质方面发挥重要作用。该研究采用RT PCR扩增方法克隆香菜CsEF 1α基因序列,利用生物信息学对CsEF 1α基因结构、序列特征及系统进化等进行分析,并采用qPCR探究CsEF 1α基因在香菜不同生长时期和非生物胁迫下的表达模式,为进一步揭示EF 1α基因调控机制的研究奠定基础。结果显示：(1)成功克隆获得香菜CsEF 1α基因序列;CsEF 1α基因包含1个1 344 bp的开放阅读框,编码447个氨基酸,分子式为C₂₂₀₂H₃₅₄₄N₅₉₄O₆₄₄S₂₀,蛋白质分子量为49.29 kD,等电点为9.12;氨基酸序列组成中赖氨酸数量最多(49个,占11.0%),色氨酸数量最少(3个,占0.7%);属碱性蛋白。(2)CsEF 1α蛋白主要由无规则卷曲(36.91%)和α 螺旋(30.43%)构成,定位于细胞质;系统进化树分析显示,CsEF 1α与胡萝卜、野生番茄、青蒿素和非洲菊的亲缘关系较接近;启动子分析包括4种植物生长发育元件、3种激素响应元件和3种胁迫响应元件。(3)qRT PCR结果显示,CsEF 1α基因的表达量随着香菜生长发育时间的延长而升高,并且与转录丰度的变化一致;CsEF 1α基因对4种不同非生物胁迫的响应表达模式有所差异;随着胁迫时间的延长,在盐胁迫下CsEF 1α基因表现出先升高后降低趋势,而在低温、高温和干旱胁迫下表现出先降低再升高的趋势。研究表明,CsEF 1α基因参与了香菜对非生物胁迫的应答,在香菜生长发育和非生物胁迫中具有重要调控作用。     

羊草DHN3基因的克隆及其逆境响应的表达分析

该研究从羊草（Leymus chinensis）中克隆得到1个脱水素（Dehydrin,DHN）编码基因LcDHN3。通过序列分析表明,LcDHN3开放阅读框为501 bp,编码167个氨基酸,分子量为17.01 kD,理论等电点为8.05,为亲水性蛋白。LcDHN3蛋白具有脱水素的保守结构域,含有1个Y 片段、1个S 片段和2个K 片段,属于YSK2型脱水素。亚细胞定位预测LcDHN3蛋白定位在细胞质和细胞核。同源比对分析显示,LcDHN3与大麦（Hordeum vulgare）等6种植物的DHNs整体相似性为84.27%。进化分析显示,LcDHN3和大麦的DHN亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,LcDHN3基因的表达受干旱、冷、热、NaCl、高pH和机械损伤胁迫诱导,同时受植物激素ABA和JA的诱导。研究表明,LcDHN3参与了羊草响应逆境胁迫的信号途径。     

茶树TIFY基因家族鉴定及非生物胁迫下表达分析

TIFY基因家族在茶树激素信号转导及其逆境胁迫具有十分重要的作用。该文利用生物信息学方法对茶树基因组中的TIFY家族进行了鉴定,分析其理化性质、系统进化、基因结构、染色体定位、启动子区顺式作用元件、组织表达模式,并通过RT-qPCR对部分TIFY家族成员进行了非生物胁迫。结果表明:(1)茶树TIFY基因家族成员19个(CsTIFY1～CsTIFY19),分属于4个蛋白亚家族TIFY、JAZ、ZML 和 PPD,且不均匀地分布在8 条染色体上,按照进化关系及结构特点可分为 7 组,每组内具有相似的基因结构与保守基序组成。(2)CsTIFYs基因的启动子区具有多种包含激素和非生物胁迫响应的顺式作用元件,通过实时荧光定量(RT-qPCR)分析其家族成员对在茉莉酸甲酯、盐(20%氯化钠)、冷(4 ℃)以及干旱(20% PEG-6000)处理下反应强烈,部分基因在根与顶芽中有较高的表达量。由此推测,TIFY基因家族可能在茶树激素信号调控、胁迫响应、生长和发育等多方面发挥功能作用。     

垫状卷柏SpLEA1基因克隆及干旱胁迫下的表达分析

晚期胚胎发育丰富蛋白(late embryogenesis abundant,LEA),广泛存在于生物体内,与植物抗逆性密切相关,可在干旱胁迫下保护植物细胞,减少植物损伤。垫状卷柏(Selaginella pulvinata)是一种在干旱胁迫下生存能力极强的蕨类植物,具有很强的恢复能力。为探究垫状卷柏SpLEA1基因在耐旱植物中的分子机制与表达特征,该研究以高耐旱性植物垫状卷柏为实验材料,基于转录组测序结果,采用RT-PCR技术获得SpLEA1基因cDNA序列,采用HiTail-PCR技术获得启动子序列,利用生物信息学对序列进行了分析,并采用qRT-PCR技术分析了SpLEA1基因在干旱胁迫下的表达模式。结果表明:(1)垫状卷柏SpLEA1全长为476 bp,开放阅读框(ORF)为279 bp,共编码92个氨基酸,通过在线工具预测到蛋白分子量为9 491.46 Da, 等电点为5.45,蛋白结构预测分析表明该蛋白为亲水性蛋白,含有10个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。(2)预测到SpLEA1蛋白的保守结构域为Lea-5,来源于LEA1家族。基于系统发生树和遗传距离矩阵,发现垫状卷柏SpLEA1与来自鹰嘴豆(Cicer arietinum )和红车轴草(Trifolium pratense)的Lea-5蛋白同源性较高。(3)对启动子序列进行顺式作用元件的预测分析发现SpLEA1基因启动子含有5类激素响应元件和与干旱胁迫响应有关的功能元件。(4)在自然干旱处理下SpLEA1基因表达上调,并在12 h时达到峰值,在24 h干旱后进行复水处理,表达量显著下调。综上所述,SpLEA1基因在垫状卷柏中很可能参与了干旱胁迫响应机制的相关调控。该结果为进一步研究垫状卷柏SpLEA1基因在干旱胁迫下的功能及其表达调控机制提供了参考。     

蒺藜苜蓿MtbHLH148转录因子的克隆与转化及其功能分析

bHLH(Basic helix loop helix, bHLH)转录因子家族是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物生长发育和盐胁迫应答机制。该研究利用同源克隆的方法克隆蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的MtbHLH148基因,采用qRT PCR方法分析MtbHLH148基因在蒺藜苜蓿中的表达特性,构建超表达载体并通过农杆菌侵染法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),对转基因拟南芥的耐盐性相关功能进行分析研究。结果显示：(1)从蒺藜苜蓿中获得MtbHLH148基因,该基因cDNA全长1 343 bp,包含开放阅读框为603 bp,编码 201 个氨基酸,蛋白分子量22.7 kD,等电点为11.76;蛋白结构分析显示,该蛋白无跨膜结构域,无信号肽,为亲水性蛋白;含有精氨酸／赖氨酸残基的保守结构域和典型的bHLH结构域;二级结构以α 螺旋和无规则卷曲为主。(2)亚细胞定位表明,MtbHLH148蛋白定位在细胞核。(3)进化树分析表明,MtbHLH148与大豆(Glycine max)的亲缘性最近;启动子分析发现,该基因启动子区域含有光响应元件、MYB结合位点以及ABA应答元件ABRE,可能参与非生物胁迫。(4)qRT PCR分析发现,MtbHLH148基因在蒺藜苜蓿的茎中表达量最高,叶中表达量最低,且MtbHLH148基因受ABA(100 μmol/L)诱导并在盐胁迫(200 mmol/L NaCl)处理8 h内表达量上调,而在低温(4 ℃)处理时表达量明显下调。(5)成功构建超表达载体pCAMBIA3301 MtbHLH148并转化拟南芥获得16个抗性株系,经鉴定有12个过表达株系,其中表达量最高的转基因株系为OE8;对OE8株系耐盐性功能分析发现,转基因拟南芥植株的发芽率明显高于野生型,盐胁迫下转基因拟南芥的根长是野生型的1.5倍,表明其耐盐性得到了增强。研究表明,MtbHLH148基因可能在盐胁迫调节机制中具有一定的调控作用。     

当归延伸因子AsEF 1β基因的克隆及胁迫应答分析

延伸因子1β(EF 1β)是蛋白质生物合成过程中肽链延长必需的调节因子之一。该研究采用同源克隆和RACE扩增技术克隆当归EF 1β基因序列,分析该基因序列特征、蛋白结构特点及UV B辐射胁迫下的组织响应表达,以揭示当归栽培生境变迁过程中对UV B胁迫适应的分子机制。结果显示：(1)成功克隆获得当归EF 1β基因全长序列(950 bp),编码225个氨基酸,命名为AsEF 1β(GenBank登录号：MG736314);AsEF 1β蛋白的分子量为24.5 kD,理论等电点为4.48,属亲水性氨基酸,在其C末端具有一个EF 1B超蛋白家族的典型结构域和保守区,鸟嘌呤核苷酸交换结构域;其氨基酸序列与同为伞形科的胡萝卜氨基酸序列相似性最高,达93%。(2)qRT PCR分析结果显示,AsEF 1β基因在当归根部的表达量显著高于茎和叶(P<0.05);UV B辐射胁迫下,茎及叶中的表达量均上调,分别是自然光照处理的2.43和3.76倍。研究表明,AsEF 1β基因可能参与当归对UV B辐射胁迫的适应过程,为深入研究其在药用植物生长发育、逆境抗性形成及药效物质的生物合成代谢过程的生态调控奠定了基础。     

檀香NDH脱氢酶基因的克隆、定位与启动子分析

为研究檀香NDH脱氢酶基因的功能和调控机制,该文以檀香心材为材料,利用RACE技术克隆SaNDH6基因的全长序列,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析其组织和激素处理后的表达模式,在拟南芥原生质体观测其亚细胞定位,利用PlantCARE分析SaNDH6起始密码子ATG上游2 kb的启动子序列,同时运用PlantRegMap预测可能与其结合的转录因子。结果表明:(1)SaNDH6编码303个氨基酸,为疏水蛋白,亚细胞定位于叶绿体。(2)进化树分析表明,檀香SaNDH6与木本植物NDH6进化关系较近。(3)PlantCARE分析发现,SaNDH6启动子中除含有ACE、AE-box、Box 4、G-Box和GT1-motif等大量光响应元件外,同时还有茉莉酸甲酯(MeJA)反应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,赤霉素(GA₃)响应元件P-box,以及防御和胁迫响应元件TC-rich repeats等。(4)PlantRegMap分析发现,有76个转录因子可能与SaNDH6启动子结合,其中ERF家族最多,达40个。(5)SaNDH6在檀香的根、心材、叶片和愈伤组织中均有表达,其中在叶片中的表达量较高; 用1×10^-4 mol·L^-1的MeJA和GA₃分别处理檀香愈伤组织后,与处理前(0 h)相比,SaNDH6的表达均在3 h后显著升高。综上结果表明,檀香SaNDH6为核基因编码的蛋白,受光和激素等诱导表达,SaNDH6可能参与檀香逆境胁迫反应的过程。     

纤枝短月藓BeLEA2基因的克隆及表达分析

为探究纤枝短月藓LEA2基因的结构和表达特征,该研究以纤枝短月藓为材料,首次利用PCR克隆技术得到纤枝短月藓BeLEA2基因序列,并对该基因进行分析。结果表明:(1)该基因序列中含有2个外显子和1个内含子,其开放阅读框(ORF)为456 bp,编码151个氨基酸,预测其相对分子质量为16515.96 Da。(2)将纤枝短月藓与其他植物LEA2基因氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示纤枝短月藓与小立碗藓的亲缘关系最近。(3)利用HiTail-PCR技术克隆获得1072 bp的BeLEA2启动子序列,用PlantCARE在线工具对该启动子的顺式作用元件进行预测,结果表明该启动子除了含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他顺式元件。(4)实时荧光定量PCR分析表明,BeLEA2基因在纤枝短月藓不同发育时期和不同组织中都有表达,且对脱水胁迫有响应。以上结果为进一步探究LEA2基因在苔藓植物中的功能及作用机制奠定了基础。     

蛇足石杉COBRA基因家族的分子生物信息学及表达分析

为探明蛇足石杉COBRA基因家族成员分子生物信息学特征及组织表达规律,该文基于蛇足石杉的全长转录组数据,通过生物信息学技术对该家族成员(HsCOBRAs)的理化性质、结构域、保守基序、顺式作用元件、基因表达量等进行分析。结果表明:(1)在蛇足石杉全长转录组中共筛选出24个HsCOBRAs家族成员,其中酸性蛋白9个,稳定蛋白11个,疏水性蛋白5个,具有跨膜结构的蛋白7个,具有信号肽的蛋白3个。(2)亚细胞定位在细胞壁、叶绿体、细胞核、细胞膜上。(3)结构分析发现HsCOBRAs有7种结构域和6种保守基序,部分成员具有高度保守的CCVS结构。(4)HsCOBRAs具有CAAT-box、TATA-box等45种顺式作用元件。(5)HsCOBRA2在叶、孢子、茎、芽胞中的表达量均最高。该研究结果可为HsCOBRAs的进一步研究及生物学功能验证等提供理论依据。     

大豆GeBP转录因子基因家族的生物信息学分析

GeBP转录因子调控植物表皮毛的生长发育,并且参与控制植物叶片的发育。该文利用生物信息学方法,在大豆全基因组范围内搜索GeBP基因家族,并从氨基酸理化性质、基因结构、染色体的物理分布、系统进化、序列比对、功能结构域、组织表达情况等基本特征方面对GmGeBP基因家族进行分析。结果表明:(1)共获得9个GmGeBP转录因子基因家族成员,其中仅2个基因含有内含子,且都只有1个内含子,表明该家族成员基因构造比较简单但稳定。(2)GmGeBP编码的蛋白分子量为39.65~49.24 kD,理论等电点为4.65~9.08;这些成员基本上都是酸性氨基酸,属于亲水性、不稳定蛋白。(3)这9个基因不均匀的分布于7条染色体上,10和20号染色体上分别分布2个GeBP基因,3、5、13、15、19号染色体上各分布1个基因。(4)系统进化分析表明,大豆与拟南芥对应的GeBP成员亲缘关系较近,分别聚类到4个分支,而与水稻的距离较远。(5)结构域分析表明,9个GmGeBP成员都包含DUF573结构域,推测该部分在GeBP转录因子中很可能是与靶标基因顺式作用元件互作的结构域。(6)通过分析大豆GmGeBP转录因子基因家族的组织表达,发现不同基因在大豆不同组织的表达量不同,具有一定的特异性。该文对大豆GeBP转录因子基因家族的分析和鉴定为进一步研究大豆表皮毛发育的分子作用提供了理论基础。     

Characterization of soybean β-expansin genes and their expression responses to symbiosis,nutrient deficiency,and hormone treatment

Expansins are plant cell wall-loosening proteins encoded by a superfamily of genes including α-expansin, β-expansin, expansin-like A, and expansin-like B proteins. They play a variety of biological roles during plant growth and development. Expansin genes have been reported in many plant species, and results primarily from graminaceous members indicate that β-expansins are more abundant in monocots than in dicots. Soybean [Glycine max (L.) Merr] is an important legume crop. This work identified nine β-expansin gene family members in soybean (GmEXPBs) that were divided into two distinct classes based on phylogeny and gene structure, with divergence between the two groups occurring more in introns than in exons. A total of 887 hormone-responsive and environmental stress-related putative cis-elements from 188 families were found in the 2-kb upstream region of GmEXPBs. Variations in number and type of cis-elements associated with each gene indicate that the function of these genes is differentially regulated by these signals. Expression analysis confirmed that the family members were ubiquitously, yet differentially expressed in soybean. Responsiveness to nutrient deficiency stresses and regulation by auxin (indole-3-acetic acid) and cytokinin (6-benzylaminopurine) varied among GmEXPBs. In addition, most β-expansin genes were associated with symbiosis of soybean inoculated with Rhizobium or abuscular mycorrhizal fungi (AMF). Taken together, these results systematically investigate the characteristics of the entire GmEXPB family in soybean and comprise the first report analyzing the relationship of GmEXPBs with rhizobial or AMF symbiosis. This information is a valuable step in the process of understanding the expansin protein functions in soybean and opens avenues for continued researches.     

厚藤脱水素基因IpDHN启动子IpDHN-Pro的克隆和调控转录活性分析

为了解厚藤(Ipomoea pes-caprae)脱水素基因IpDHN (GenBank登录号:KX426069)启动子的转录活性和对非生物胁迫和植物激素ABA的响应,通过染色体步移法克隆了IpDHN的上游启动子序列IpDHN-Pro,长度为974 bp。构建IpDHN-Pro调控下GUS转基因载体,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株获得IpDHN-Pro::GUS转基因植株并进行GUS染色,验证IpDHN-Pro启动转录活性以及在氯化钠、甘露醇、ABA处理后拟南芥GUS基因表达变化。结果表明,扩增获得的IpDHN-Pro序列包含多个顺式作用元件,包括1个ABRE、3个Myb转录因子结合位点、富含TC的重复序列以及Skn-1基序等。转基因拟南芥GUS染色及qRT-PCR表明该序列可驱动GUS基因在拟南芥稳定表达,且表达受高盐、渗透压及ABA的诱导。这表明IpDHN-Pro是一个盐旱、ABA诱导的启动子序列,可应用于相关的植物抗逆遗传工程研究。     

水稻胁迫相关基因OsPM1启动子的克隆与分析

依据NCBI数据库OsPM1的序列信息,采用PCR技术扩增获取OsPM1的2 100bp的启动子序列。利用PLACE预测启动子的顺式作用元件分析表明,启动子内含有大量与胁迫相关的顺式作用元件,主要有ABA响应相关元件、脱水响应元件、低温响应元件、热激响应元件和转录因子结合元件。构建OsPM1的启动子和GUS基因融合表达载体,转入拟南芥。组织化学染色分析结果显示,非生物胁迫处理前,幼苗中GUS基因表达水平很低;干旱、低温、高盐等胁迫处理后,GUS基因表达量显著升高。研究表明,OsPM1的启动子能够显著提高在干旱、高盐和低温处理后下游基因的表达水平。     

滇龙胆8-羟香叶醇氧化还原酶基因的克隆与表达分析

滇龙胆主要药效成分为龙胆苦苷,而8-羟香叶醇氧化还原酶基因Gr8HGO是龙胆苦苷生物合成途径的结构基因。为了研究Gr8HGO基因的功能,该文克隆了滇龙胆Gr8HGO基因,并进行表达分析。结果表明:(1)共克隆到5个Gr8HGO基因,其GenBank登录号分别为KP722029.1 (Gr8HGO-1)、KP722030.1(Gr8HGO-2)、KP722031.1(Gr8HGO-3)、KP722032.1(Gr8HGO-4)、KP723852.1(Gr8HGO-5)。(2) Gr8HGO-1基因全长1 062 bp,编码353个氨基酸,其他4个基因全长1 131 bp,编码376个氨基酸;理化性质分析结果表明5个蛋白单体相对分子质量约40 kD,理论等电点在5.47～5.95之间,均为疏水稳定蛋白。(3)信号序列分析结果表明5个蛋白均不含信号肽、跨膜螺旋和叶绿体转运肽;亚细胞定位分析结果表明5个蛋白可能定位于细胞质;结构域预测结果表明除Gr8HGO-1蛋白仅包含乙醇脱氢酶N端结构域(IPR013154)和C端结构域(IPR013149)外,其他4个蛋白还包含聚酮合酶、烯酰还原酶结构域(...