中华鳖Dmrt1基因在雄性性别分化中的功能分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文通过慢病毒-Dmrt1-sh RNA干扰和Dmrt1-OE过表达载体系统的构建,成功实现了Dmrt1基因在中华鳖胚胎发育过程中的高效异常表达,以探讨Dmrt1在中华鳖雄性性别分化中的功能.结果显示,经过Dmrt1-sh RNA干扰处理后的ZZ胚胎,32.0%发育成雌性(生理)个体,而经过Dmrt1-OE过表达处理后,25.5%的ZW胚胎发育成雄性(生理)个体.苏木素/伊红(HE)染色、q PCR和免疫组化分析表明,Dmrt1基因敲低后,ZZ胚胎性腺外形和组织结构明显雌性化,雄性特异性基因Amh和Sox9表达显著降低,雌性特异性基因Cyp19a1和Foxl2表达则显著上升,出现雄向雌的性逆转现象;而Dmrt1过表达后的ZW胚胎性腺则向睾丸分化,Amh和Sox9表达急剧上调,Cyp19a1和Foxl2表达显著下降,呈现雌转雄性逆转现象.上述研究表明,Dmrt1基因在中华鳖早期雄性性别形成过程中是必需的,且它的异位表达能够单独启动雄性分化,是中华鳖雄性性别分化的关键因子.     

中华鳖Amh基因的克隆、表达及在雄性分化中的功能初探

为了阐明Amh基因在中华鳖雄性性别分化中的调控作用,本研究对Amh基因进行cDNA序列克隆和表达分析,同时通过慢病毒介导的RNA干扰技术对Amh基因进行了功能验证.RACE结果显示,中华鳖Amh基因的cDNA序列全长为3233 bp,5'非翻译区为997 bp,3'非翻译区为834 bp,可读框为1401 bp,编码466个氨基酸.实时荧光定量PCR结果显示,在成体组织中,Amh基因在睾丸中高度特异性表达;在胚胎发育过程中Amh基因在性别分化启动前的第16期便开始呈现雄性特异性表达,并贯穿此后整个发育时期,而在雌性性腺中则维持非常低的表达水平.在芳香化酶抑制剂诱导的雌性向雄性性逆转胚胎性腺中Amh表达显著上升;在雌二醇诱导的雄性向雌性性腺中,Amh表达则显著下降.RNA干扰实验表明,Amh基因敲低后,ZZ(基因型雄性)胚胎性腺外形和组织结构明显雌性化,皮质区发育,而髓质区高度退化,出现雄性转雌性的性逆转现象;同时雄性分化相关基因Sox9表达下调,而雌性分化相关基因Cypl9al表达则急剧上调.上述结果表明,中华鳖Amh是雄性特异性因子,在早期雄性性别分化过程中是必需的关键基因,本研究为中华鳖性别决定机制研究奠定了基础.     

Sox8基因过表达诱导中华鳖ZW性腺的雄性分化

为了研究Sox8基因在中华鳖性别分化中的功能,研究利用慢病毒介导的过表达载体,在性别分化前的雌性中华鳖中过表达Sox8。通过组织学分析和生殖细胞标记蛋白VASA的免疫荧光染色发现在Sox8过表达后,50%的ZW性腺髓质区发育出睾丸特有的、含有生殖细胞的性索结构; qRT-PCR和免疫荧光结果显示雌性特异性基因Foxl2和Cyp19a1表达量显著降低,而调控睾丸发育的Dmrt1、Sox9和Amh基因表达上调。实验结果表明Sox8的过表达诱导ZW胚胎性腺往雄性方向分化,揭示了Sox8在中华鳖睾丸分化过程中的作用。     

Cyp19a1基因在中华鳖早期卵巢分化中的功能研究

芳香化酶是雌激素合成的关键酶,在非哺乳类脊椎动物的早期雌性性腺分化中起重要的调控作用.本研究首先分析了中华鳖(Pelodiscus sinensis)芳香化酶编码基因Cyp19a1在不同组织及不同发育时期雌雄胚胎性腺中的表达情况;其次,利用芳香化酶抑制剂(AI)和慢病毒RNA干扰及过表达技术,进行Cyp19a1基因的功能验证研究.研究结果表明,Cyp19a1基因在中华鳖成体卵巢组织中高度特异性表达,睾丸和心、肝、脾、肺、肾、肌、肠中未见表达.同时发现,Cyp19a1基因在第18期就呈现雌性性腺特异性表达,早于性腺分化启动时间(第19期).功能缺失实验表明,经过AI及Cyp19a1-shRNA处理后,ZW胚胎性腺皮质区退化,髓质区高度发育,形成原始性索结构,呈现雌性向雄性性逆转现象;同时雌性标记基因Foxl2的表达量下调,雄性标记基因Amh的表达量则显著上调.功能获得实验则表明,Cyp19a1过表达后的ZZ型性腺皮质区高度发育,髓质区退化,形成空洞结构,呈典型雌性特征,同时Foxl2基因的表达量上升,Amh的表达量显著降低.综上所述,本文证明了Cyp19a1是中华鳖早期卵巢分化的关键调控因子,为中华鳖性别分化机制研究奠定了基础.     

胡子鲇Dmrt1基因全长cDNA克隆及其表达分析

以胡子鲇(Clarias fuscus)为研究对象,利用RT-PCR技术和SMART RACE技术克隆获得Dmrt1基因cDNA全长,并利用生物信息学分析其结构及功能;利用半定量RT-PCR技术检测胡子鲇性腺(精巢/卵巢)、肌肉、肠、肝脏、心脏、头肾、鳃丝、脑和眼等10种组织以及Ⅱ—Ⅴ期精巢中Dmrt1基因表达。结果表明:胡子鲇Dmrt1基因cDNA全长为1417 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)为35 bp,3′非编码区(3′-UTR)为516 bp,开放阅读框(ORF)包含864 bp,编码287个氨基酸(aa),预测所编码DMRT1为主要位于细胞核内的不稳定性亲水蛋白。氨基酸序列比对显示,胡子鲇DMRT1与已公布的非洲胡子鲇、蟾胡子鲇、黄颡鱼等鲇形目鱼类的相似性为83.3%—96.1%。胡子鲇DMRT1中具有DMRT基因家族共有的、保守性很高的DM结构域,此结构域具有典型的"C2H2C4"锌指结构,与上述鲇形目鱼类的相似性达100%,与斑马鱼、青鳉、虹鳟等鱼类的相似性为91.9%—97.3%,而与鸡、鼠、猪人等的相似性达80%以上。组织表达显示,胡子鲇Dmrt1基因仅在精巢中表达,且Ⅱ期精巢(即精子发生期)中Dmrt1基因表达量显著高于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期精巢(P<0.05),而卵巢及其他8种组织中均无表达,表明Dmrt1是胡子鲇精巢特异性表达基因,可能与胡子鲇的雄性性别决定、精子发生及精巢发育密切相关。     

温度对池蝶蚌雌雄同体和性逆转的影响

为探究温度对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)性腺发育的影响, 研究连续两年对池蝶蚌性腺进行雌雄同体现象筛选及跟踪观察, 并采用5个温度诱导池蝶蚌生殖滤泡分化。通过对不同时期的池蝶蚌的性腺进行qRT-PCR检测, 同时利用原位杂交技术对性别决定关键基因Dmrt1进行细胞定位。结果显示: 在自然条件下, 6月龄池蝶蚌出现了雌雄同体现象, 28月龄的雌雄同体蚌到30月龄左右会出现不同性别的分化(77.8%分化为雄蚌, 16.7%维持雌雄同体现象, 5.5%分化为雌蚌)。在不同温度刺激下, 14月龄池蝶蚌出现了雌雄同体和性逆转现象。32℃刺激, 14月龄雄蚌出现12.5%雌雄同体; 27℃刺激, 14月龄雄蚌和27月龄雄蚌分别出现37.5%和12.5%性逆转; 23℃刺激, 14月龄雌蚌出现14.29%性逆转; 19℃刺激, 14月龄雌蚌出现25%性逆转。qRT-PCR结果显示: Dmrt1在胚胎及6、27月龄表达显著高于其他时期, 32℃刺激, 在27月龄雄蚌中的表达显著高于其他温度, 19℃刺激, 在14、27月龄雌蚌中的表达显著高于其他温度; Fem1b、Fem1c的时空表达趋势基本一致, 与Tra2a大体一致, 在5、32月龄与Sox9相互抑制; 19℃、23℃和27℃刺激, Fem1b、Tra2a和Sox9三个基因在14月龄雄蚌中表达显著高于其他温度, 且23℃刺激, Sox9在27月龄雄蚌中表达也显著高于其他温度; Foxl2在27℃下的27月龄雌蚌中表达显著高于其他温度。Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五个基因在不同月龄的雌雄同体蚌内表达有显著差异, Foxl2在雌蚌和雌雄同体蚌内表达显著高于同期雄蚌。原位杂交技术结果显示, Dmrt1 mRNA阳性信号主要定位在精原细胞、初级精母细胞和成熟卵母细胞中。综上所述, 温度影响池蝶蚌生殖滤泡的分化, 27℃及以上的高温容易诱导雄蚌向雌蚌逆转或产生雌雄同体现象, 23℃及以下的低温容易诱导雌蚌向雄蚌逆转; 并且温度很可能是通过调控Dmrt1等性别相关基因的表达量, 从而调节生殖滤泡分化的。     

Expression of Dmrt1 in the genital ridge of mouse and chicken embryos suggests a role in vertebrate sexual development.

Sex-determining mechanisms are highly variable between phyla. Only one example has been found in which structurally and functionally related genes control sex determination in different phyla: the sexual regulators mab-3 of Caenorhabditis elegans and doublesex of Drosophila both encode proteins containing the DM domain, a novel DNA-binding motif. These two genes control similar aspects of sexual development, and the male isoform of DSX can substitute for MAB-3 in vivo, suggesting that the two proteins are functionally related. DM domain proteins may also play a role in sexual development of vertebrates. A human gene encoding a DM domain protein, DMRT1, is expressed only in the testis in adults and maps to distal 9p24.3, a short interval that is required for testis development. Earlier in development we find that murine Dmrt1 mRNA is expressed exclusively in the genital ridge of early XX and XY embryos. Thus Dmrt1 and Sry are the only regulatory genes known to be expressed exclusively in the mammalian genital ridge prior to sexual differentiation. Expression becomes XY-specific and restricted to the seminiferous tubules of the testis as gonadogenesis proceeds, and both Sertoli cells and germ cells express Dmrt1. Dmrt1 may also play a role in avian sexual development. In birds the heterogametic sex is female (ZW), and the homogametic sex is male (ZZ). Dmrt1 is Z-linked in the chicken. We find that chicken Dmrt1 is expressed in the genital ridge and Wolffian duct prior to sexual differentiation and is expressed at higher levels in ZZ than in ZW embryos. Based on sequence, map position, and expression patterns, we suggest that Dmrt1 is likely to play a role in vertebrate sexual development and therefore that DM domain genes may play a role in sexual development in a wide range of phyla.