Butyrylcholinesterase Antisense Transfection Increases Apoptosis in Differentiating Retinal Reaggregates of the Chick Embryo

Abstract: To investigate the roles of the enzymes butyryl- and acetylcholinesterase (BChE and AChE) in retinal proliferation and differentiation, we use reaggregated spheres from retinal cells of the 6-day-old chick embryo, forming cellular and fibrous areas homologous to all layers of a normal retina. Recently, we could suppress BChE expression by transfecting these so-called retinospheroids during their proliferation period with a pSVK3 expression vector containing a 5' fragment of the rabbit BChE gene in antisense orientation. Along with morphological changes, proliferation was significantly decreased. Here, we have studied the effect of antisense BChE suppression during the differentiation period of retinospheroids. As BChE is suppressed, the differentiation of AChE-positive cells is increased, whereas the immunoreactivities for red and green cone-specific opsins are strongly reduced. Concomitantly, the rate of apoptosis as determined by propidium iodide uptake, by increased CPP 32-like caspase expression, and by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling and DNA fragmentation assays is roughly doubled, predominantly at the expense of degenerating photoreceptor precursors. This is further strong evidence that the proliferation marker BChE regulates an intricate balance between cell proliferation, cell differentiation, and programmed cell death in this in vitro retinal system.     

Dyrk1A Phosphorylates p53 and Inhibits Proliferation of Embryonic Neuronal Cells

Down syndrome (DS) is associated with many neural defects, including reduced brain size and impaired neuronal proliferation, highly contributing to the mental retardation. Those typical characteristics of DS are closely associated with a specific gene group “Down syndrome critical region” (DSCR) on human chromosome 21. Here we investigated the molecular mechanisms underlying impaired neuronal proliferation in DS and, more specifically, a regulatory role for dual-specificity tyrosine-(Y) phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A), a DSCR gene product, in embryonic neuronal cell proliferation. We found that Dyrk1A phosphorylates p53 at Ser-15 in vitro and in immortalized rat embryonic hippocampal progenitor H19-7 cells. In addition, Dyrk1A-induced p53 phosphorylation at Ser-15 led to a robust induction of p53 target genes (e.g. p21^CIP1) and impaired G₁/G₀-S phase transition, resulting in attenuated proliferation of H19-7 cells and human embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Moreover, the point mutation of p53-Ser-15 to alanine rescued the inhibitory effect of Dyrk1A on neuronal proliferation. Accordingly, brains from embryonic DYRK1A transgenic mice exhibited elevated levels of Dyrk1A, Ser-15 (mouse Ser-18)-phosphorylated p53, and p21^CIP1 as well as impaired neuronal proliferation. These findings suggest that up-regulation of Dyrk1A contributes to altered neuronal proliferation in DS through specific phosphorylation of p53 at Ser-15 and subsequent p21^CIP1 induction.     

白藜芦醇通过降低galectin-3 的表达抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖并促进其凋亡

目的：探讨白藜芦醇对人宫颈癌SiHa 细胞增殖和凋亡的影响及galectin-3 在其中的作用。方法：以体外培养的人宫颈癌 SiHa 细胞为研究对象,实验分为对照组、白藜芦醇处理组及[白藜芦醇+galectin-3(5、10、20 ug/mL)]共5 组,分别给予生理盐水、 300 umol/L白藜芦醇及[300 umol/L白藜芦醇+Galectin-3 (5、10、20 ug/mL)]处理。48 小时后,分别收集各组细胞,采用MTT法检 测细胞的增殖情况,Caspase-3 活性试剂盒测定细胞的凋亡情况,Western Blot技术测定细胞内galectin-3 的蛋白表达水平。结果： 300 umol/L的白藜芦醇明显抑制SiHa 细胞的增殖,并显著增加其凋亡水平,同时减少了细胞内galectin-3 的蛋白表达。在白藜芦 醇处理的同时,给予5、10 及20 ug/mL 的Galectin-3,随着Galectin-3 蛋白浓度的增加,SiHa 细胞的增殖抑制率逐渐降低,凋亡水 平也逐渐下降,但是VEGF-R3 受体的磷酸化水平却逐渐升高。结论：白藜芦醇通过降低galectin-3 的表达抑制宫颈癌SiHa 细胞 的增殖并促进其凋亡。     

白藜芦醇通过降低galectin-3的表达抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖并促进其凋亡

目的：探讨白藜芦醇对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响及galectin-3在其中的作用。方法：以体外培养的人宫颈癌SiHa细胞为研究对象,实验分为对照组、白藜芦醇处理组及[白藜芦醇＋galectin-3（5、10、20μg/mL）]共5组,分别给予生理盐水、300μmol/L白藜芦醇及[300μmol/L白藜芦醇＋Galectin-3（5、10、20μg/mL）]处理。48小时后,分别收集各组细胞,采用MTT法检测细胞的增殖情况,Caspase-3活性试剂盒测定细胞的凋亡情况,Western Blot技术测定细胞内galectin-3的蛋白表达水平。结果：300μmol/L的白藜芦醇明显抑制SiHa细胞的增殖,并显著增加其凋亡水平,同时减少了细胞内galectin-3的蛋白表达。在白藜芦醇处理的同时,给予5、10及20μg/mL的Galectin-3,随着Galectin-3蛋白浓度的增加,SiHa细胞的增殖抑制率逐渐降低,凋亡水平也逐渐下降,但是VEGF-R3受体的磷酸化水平却逐渐升高。结论：白藜芦醇通过降低galectin-3的表达抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖并促进其凋亡。     

NG2-神经元突触联系在NG2细胞增殖分化过程中的变化

NG2细胞是广泛分布于CNS中表达NG2蛋白多糖的一种胶质细胞,也被称为少突胶质前体细胞（oligodendrocyteprecur—sorcells,oPc）。该细胞具有典型复杂的星形形态和长突起围绕于胞体周围,表达电压门控的K＋和Na＋通道、GABAA以及AMPA／红藻氨酸受体并接受神经元突触的信号输入。NG2细胞增殖分化是保证神经元轴突髓鞘化的首要前提,NG2的增殖分化不能仅依靠其自身调控,NG2-神经元突触联系可能也是调控NG2细胞增殖分化的信息中转站。伴随NG2细胞增殖分化神经元轴突的髓鞘化也不断形成,这些过程在围生期表现尤为明显;NG2细胞分化为少突胶质细胞后,其功能上具有”专一性”,所以可能存在NG2．神经元突触联系的作用被削弱的现象。因此,在NG2细胞增殖过程中,NG2细胞保持与神经元之间的功能性突触并将其传递给子代NG2细胞;而在NG2细胞分化的过程中,NG2细胞的突触信号输入迅速减少。NG2细胞不但是一种前体细胞,同时也是一种具有独特功能的胶质细胞,在中枢神经系统中发挥重要作用。本综述就NG2细胞在增殖分化过程中其突触信号的变化以及可能的意义进行阐述。     

萼脊兰ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义基因表达载体的构建

根据已报道的几种不同属的兰科植物ACO基因序列,设计并合成了一对特异引物,以萼脊兰的基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出萼脊兰ACO基因的部分片段,将其连接到pMD19-T质粒载体上进行测序.结果显示,该片段的长度为333 bp,序列和蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrid)、卡特兰(Cattleya intermedia)、两棱蕾丽兰(Laelia anceps)的相应ACO片段的同源性分别达到达到99.7%、92.49%和92.19%;和大花蕙兰(Cymbidium hybrid)、石斛兰(Dendrobium crumenatum)的同源性分别是89.49%和89.19%.将此片段反向插入植物表达载体pBI221的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,成功构建了萼脊兰ACO的反义基因植物表达载体pBI-antiACO.     

癌基因EJ－ras在小鼠胚胎干细胞（ES－5）中的表达及其对ES－5细胞一些特征的影响

转基因动物在研究基因的功能、医药、畜牧业等方面有重要的应用。利用胚胎干细胞（ＥＳ）制作转基因动物,比传统的显微注射法有无可比拟的优点。但是,目前、只在小鼠中建立起了ＥＳ细胞系,在其它哺乳动物（包括家畜）中尚未建成。近来,人们开始探索：改变胚胎细胞的遗传物质（如：把外源基因导入胚胎细胞）是否有利于获得ＥＳ细胞系．在各种外源基因中,癌基因是值得尝试的基因。因为：（１）ＥＳ细胞的建系是使胚胎的ＩＣＭ细胞永生化的过程;（２）在体外利用癌基因转染可使许多原代培养细胞永生化;（３）ＥＳ细胞高表达一些原癌基因。我们用癌基因ＥＪ－ｒａｓ转染小鼠ＥＳ细胞,观察其对ＥＳ－５细胞一些特性（增殖、嵌合能力）的影响,以便选择合适的癌基因用于家畜ＥＳ细胞的建系。ＥＳ－５细胞通常培养在丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥＦ）上（Ｆｉｇ．Ａ）。转染用ＥＳ－５细胞培养在无饲养层细胞的、含有大鼠肝细胞（ＢＲＬ）的条件培养液ＤＭＥＭ中。ＥＪ－ｒａｓ基因克隆在真核表达载体ＰＳＶ２ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ位点上、使用磷酸钙法转染ＥＳ－５细胞,Ｇ－４１８法筛选阳性克隆,得到的抗性克隆仍以集落形式生长（Ｆｉｇ．Ｂ）,选取５个较好的克隆（ＥＳ－ｒａｓ１,２,     

Antisense targeting of TGF-beta1 augments BMP-induced upregulation of osteopontin, type I collagen and Cbfa1 in human Saos-2 cells

Despite commonalities in signal transduction in osteoblasts from different species, the role of TGF-beta1 on bone formation remains elusive. In particular, the role of autocrine TGF-beta1 on human osteoblasts is largely unknown. Here we show the effect of TGF-beta1 knock-down on the proliferation and differentiation of osteoblasts induced by BMP2. Treatment with antisense TGF-beta1 moderately increased the rate of cell proliferation, which was completely reversed by the exogenous addition of TGF-beta1. Notably, TGF-beta1 blockade significantly enhanced BMP2-induced upregulation of mRNAs encoding osteopontin, type I collagen and Cbfa1, which was suppressed by exogenous TGF-beta1. Moreover, TGF-beta1 knock-down increased BMP2-induced phosphorylation of Smad1/5 as well as their nuclear import, which paralleled a reduction of inhibitory Smad6. These data suggest autocrine TGF-beta1 antagonizes BMP signaling through modulation of inducible Smad6 and the activity of BMP specific Smad1/5.     

鸭梨ACC氧化酶基因cDNA片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化

研究根据ACC氧化酶基因的保守序列设计一对特异性引物。以鸭梨果实为试材,借助RT,PCR方法扩增得到一条长度为831bp的鸭梨ACC氧化酶基因eDNA片段,该片段编码276个氨基酸残基,与其它梨品种ACC氧化酶基因序列同源性均在94％以上。将此片段反向插入真核表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建了鸭梨ACC氧化酶基因的反义表达载体．并在农杆菌LBA4404的介导下实现对鸭梨组培苗的遗传转化。经PCR鉴定证实共有4株鸭梨组培苗中外源基因得到成功转化,Southern杂交显示在这4株转基因鸭梨中除有1株外源基因呈双拷贝外,其余3株中外源基因均以单拷贝形式存在。     

鸭梨ＡＣＣ 氧化酶基因ｃＤＮＡ 片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化

研究根据ACC氧化酶基因的保守序列设计一对特异性引物,以鸭梨果实为试材,借助RT PCR方法扩增得到一条长度为831bp的鸭梨ACC氧化酶基因cDNA片段,该片段编码276个氨基酸残基,与其它梨品种ACC氧化酶基因序列同源性均在94%以上。将此片段反向插入真核表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了鸭梨ACC氧化酶基因的反义表达载体,并在农杆菌LBA4404的介导下实现对鸭梨组培苗的遗传转化。经PCR鉴定证实共有4株鸭梨组培苗中外源基因得到成功转化,Southern杂交显示在这4株转基因鸭梨中除有1株外源基因呈双拷贝外,其余3株中外源基因均以单拷贝形式存在。     

miR-203在肝细胞肝癌中的表达及其对肿瘤细胞增殖及侵袭能力的影响

目的:探讨miR-203在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者血浆中的表达及其对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:选择2013年5月-2015年7月在我院确诊为肝细胞肝癌的患者57例作为研究对象,另选取同期在我院接受健康体检的志愿者49例作为对照组。采用实时荧光定量RT-PCR法检测两组血浆中miR-203的表达水平;将过表达的miR-203转染至人肝癌细胞系Hep 3B和JHH-1;采用CCK-8法检测miR-203对肝癌细胞增殖能力的影响;采用transwell法检测miR-203对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响。结果:miR-203在肝癌患者血浆中的表达水平显著低于对照组,差异具有统计学意义(P0.01);与未转染的肝癌细胞比较,Hep 3B和JHH-1细胞转染miR-203mimic后,肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力受到明显抑制,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:miR-203在肝细胞肝癌中呈低表达,而过表达miR-203能够抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭能力,提示miR-203可以作为一种新的肿瘤抑制性micro RNA。     

Distinct Mechanisms of Differentiation of SH-SY5Y Neuroblastoma Cells by Protein Kinase C Activators and Inhibitors

Certain biological actions of phorbol esters cannot be duplicated by diacylglycerol (DAG). Thus, the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y differentiates when exposed to 12-tetradecanoyl-13-acetyl-beta-phorbol (TPA) and protein kinase C (PKC) inhibitors, but not when exposed to DAG. To investigate the specific features of the phorbol diester molecule that might be responsible for these effects, we examined the extension of neurites, expression of neuron-specific enolase, and appearance and localization of phosphorylated high molecular weight neurofilament subunits (NF-H). TPA, 12-deoxy-13-tetradecanoyl-beta-phorbol, and staurosporine, but not DAG or 4-O-methyl-TPA, caused neurite outgrowth. Neuron-specific enolase was expressed in cells treated with TPA and 12-deoxy-13-tetradecanoyl-beta-phorbol but not with DAG, staurosporine, or 4-O-methyl-TPA. NF-H increased in the perikarya of cells treated with DAG and 4-O-methyl-TPA, in processes and to varying degrees in perikarya of TPA- and 12-deoxy-13-tetradecanoyl-beta-phorbol-treated cells, but much more in the processes than in the perikarya of staurosporine-differentiated cells. These findings and additional differences between the differentiation induced by TPA (a PKC activator) and staurosporine (a PKC inhibitor), including distinct morphology of the cell body and processes and time of appearance of the morphological phenotype, suggest that activators and inhibitors of PKC induce differentiation of SH-SY5Y cells by different mechanisms, and that the five-membered/seven-membered terpene ring region present in TPA must be intact for the induction of morphological differentiation.     

miR-195通过下调IGF-1R的表达抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移

目的:探讨miR-195对胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)增殖和迁移的影响,并阐明其分子调控机制。方法:采用qRT-PCR检测不同级别胶质瘤中miR-195的表达。将miR-195转染至胶质瘤U251细胞后,应用qRT-PCR验证转染效率,MTT及划痕实验检测U251细胞的增殖及迁移能力的改变,qRT-PCR及Western blot检测胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1receptor, IGF-1R)的mRNA和蛋白表达;利用质粒转染过表达miR-195后,同时过表达IGF-1R,再应用MTT及划痕实验检测U251细胞的增殖及迁移能力的变化。结果:随着胶质瘤级别的增加,miR-195的表达逐渐降低,各级别胶质瘤中miR-195的表达差异有统计学意义(P0.05)。体外转染miR-195至U251细胞24、48、72 h后,转染组细胞活力和迁移能力均较对照组显著降低(P0.05),细胞中IGF-1R的mRNA和蛋白的表达也明显减少(P0.05);通过转染IGF-1R过表达质粒可显著逆转miR-195过表达对U251细胞增殖及迁移的抑制作用。结论:miR-195可能通过下调IGF-1R的表达,进而抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移。     

慢病毒介导的GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞表达及对细胞增殖性影响的研究

目的：建立真核细胞表达的GFP-Hsp90αE47A基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统,并检测其对细胞增殖性的影响,为进一步研究HSP90分子伴侣功能奠定基础。方法：制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒（Hsp90αE47A/psin-GFP）,包装质粒（ΔNRF）及包膜蛋白质粒（VSV-G）。磷酸钙法将三质粒共转染293T包装细胞,48h后收集病毒上清。将制备好的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况,Westernblot检测HepG2细胞GFP-Hsp90α表达。MTT法检测细胞增殖情况。结果：转染后的293T和感染后的HepG2细胞能观察到较强的绿色荧光,培养液上清病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,HepG2细胞中有GFP-Hsp90α蛋白的表达。内源性Hsp90α表达无明显上升（为对照组的1.05±0.15倍,P〈0.05,t检验）,有明显外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达,为对照组内源性Hsp90α的0.68±0.12倍。外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达HepG2细胞增殖活性于第4d有明显抑制。（1.051±0.03vs1.349±0.05,P〈0.05,t检验）。结论：成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统,并将GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞中稳定表达,且并未引起细胞明显的热休克反应而导致的内源性Hsp90α增高;且能明显抑制细胞增殖,为后期Hsp90α分子伴侣功能进行研究奠定基础。     

慢病毒介导的GFP-Hsp90αE47A 基因在HepG2 细胞表达及对 细胞增殖性影响的研究

目的:建立真核细胞表达的GFP-Hsp90αE47A基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统,并检测其对细胞增殖性的影响,为进一步研究HSP90分子伴侣功能奠定基础。方法:制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统:转移质粒(Hsp90αE47A/psin-GFP),包装质粒(ΔNRF)及包膜蛋白质粒(VSV-G)。磷酸钙法将三质粒共转染293T包装细胞,48h后收集病毒上清。将制备好的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况,Westernblot检测HepG2细胞GFP-Hsp90α表达。MTT法检测细胞增殖情况。结果:转染后的293T和感染后的HepG2细胞能观察到较强的绿色荧光,培养液上清病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,HepG2细胞中有GFP-Hsp90α蛋白的表达。内源性Hsp90α表达无明显上升(为对照组的1.05±0.15倍,P<0.05,t检验),有明显外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达,为对照组内源性Hsp90α的0.68±0.12倍。外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达HepG2细胞增殖活性于第4d有明显抑制。(1.051±0.03vs1.349±0.05,P<0.05,t检验)。结论:成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统,并将GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞中稳定表达,且并未引起细胞明显的热休克反应而导致的内源性Hsp90α增高;且能明显抑制细胞增殖,为后期Hsp90α分子伴侣功能进行研究奠定基础。     

TIMP-1基因缄默削弱SH-SY5Y细胞的增殖潜能并诱导其凋亡增强

前期研究发现,人基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1,TIMP-1)在唐氏综合征（Down’s syndrome ,DS)胎儿脑组织内表达下调．为了探讨TIMP-1表达下调参与DS脑病变发生的可能机制,本研究以人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）为模型,观察TIMP-1基因沉默后对其增殖和凋亡的影响．应用LipofectaminTM2000将TIMP-1特异性短发卡 RNA( short hairpin RNA,shRNA)导入SH-SY5Y细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达TIMP-1-shRNA细胞株;应用RT-PCR、real-time PCR和Western 印迹对干扰效率进行鉴定：与SH-SY5Y细胞相比,无论在mRNA水平还是蛋白水平,SH-SY5Y-TIMP-1-shRNA细胞中TIMP-1的表达显著下调（下调率接近100%）．结果显示,已成功构建了TIMP-1基因沉默的SH-SY5Y细胞模型．在此基础上,通过MTT检测发现,TIMP-1基因沉默后SH-SY5Y细胞增殖减慢;流式细胞仪和荧光显微镜凋亡检测显示,TIMP-1基因沉默后SH-SY5Y细胞凋亡明显增加．这些研究结果表明,TIMP-1基因沉默能削弱SH-SY5Y细胞的增殖能力并增强SH-SY5Y的凋亡效应,提示TIMP-1可能是通过影响神经细胞的增殖和凋亡参与DS智力低下的发病过程．     

维甲酸对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖和相关基因表达的影响

目的:研究维甲酸对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖和相关基因表达的影响,以探索其对成骨肉瘤细胞的生物学效应.方法:以1μmol/L维甲酸处理人成骨肉瘤MG-63细胞,生长曲线测定,流式细胞仪分析、光镜观察和免疫细胞化学检测等研究维甲酸对MG-63细胞的生长曲线、细胞周期和相关癌基因、抑癌基因表达的影响,并对其作用机理进行初步分析.结果:维甲酸处理7天后,MG-63细胞生长抑制率达到42.2%,G0/G1期比例达到61.8%,细胞形态铺展,排列趋于规则,癌基因c-myc、c-fos的表达降低.而抑癌基因Rb、p27表达上调.结论:1μmol/L维甲酸可以有效抑制细胞的增殖活动,改变细胞恶性形态特征,下调癌基因c-myc、c-fos和上调抑癌基因Rb、p27的表达,从而对人成骨肉瘤细胞分化具有诱导作用.     

pemt2-cDNA的转染抑制大鼠CBRH-7919肝癌细胞c-Met及Bcl-2的表达并诱发凋亡

为探讨磷脂酰乙醇胺 N 甲基转移酶 2 (phosphatidylethanolamine N methyltransferase 2 ,PEMT2 )的转染抑制大鼠肝癌CBRH 7919细胞增殖的分子机理 ,构建了带有完整的pemt2 cDNA基因质粒载体 ,经转染和鉴定 ,确知其在大鼠肝癌细胞系CBRH 7919细胞中稳定高表达 .用细胞培养、免疫细胞化学、Western印迹、流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳等技术研究c Met(HGF的受体 )及抗凋亡蛋白Bcl 2在此过程中的表达和是否诱发凋亡 .免疫组织化学及Western印迹分析显示在转染高表达细胞中 ,c Met及Bcl 2的表达下调 .流式细胞仪分析表明 ,在转染pemt2 cDNA的高表达细胞中 ,G1期细胞增加 ,S期细胞减少 ,并在G0 期出现一个凋亡峰 .琼脂糖凝胶电泳谱显示梯状条带 .结果表明 :pemt2的转染可使大鼠肝癌细胞的c Met及Bcl 2的表达下调 ,并发生凋亡 .