Gene cloning, expression and purification of human mitochondrial tRNA~(Leu(UUR)) and its mutant

Genes of human mitochondrial tRNALeu(UUR) (mtRNALeu(UUR)) and its mutant (mtRNALeu(M)) were synthesized and inserted into the plasmid pGEM-9Zf(-) respectively. E.coli JM 109 was transformed by the recombinant plasmids containing the target genes. The mtRNALeu(UUR) and mtRNALeu(M) were expressed up to 19.10% and 17.76% of total small RNA respectively. They were purified to 54% homogeneity by DEAE-sepharose-CL4B column chromatography and finally repu-rified by 15% PAGE/urea. Their kinetic parameters for E.coli LeuRS were measured. The results showed that the value of kcal/Km of mtRNALeu(M) was about one fifth of that of mtRNALeu(UUR) and indicated the leucine acceptability of mtRNALeu(M) was much lower than that of mtRNALeu(UUR).     

人线粒体tRNALeu(UUR)基因A3243G点突变对其亮氨酰化活性的影响

化学法合成人线粒体野生型与A3243G点突变型tRNALeu(UUR)基因,体外转录生成相应的tRNALeu(UUR),表达并纯化人线粒体亮氨酰tRNA合成酶(mtLeuRS),用mtLeuRS催化野生型与突变型tRNALeu(UUR)与亮氨酸结合,分别检测两种类型tRNALeu(UUR)的氨酰化动力学常数。结果表明,野生型tRNALeu(UUR)的Km/Kcat仅为突变型tRNALeu(UUR)的63.9%,A3243G点突变使tRNALeu(UUR)接受亮氨酸的能力明显下降,提示此为A3243G点突变致病机制之一。 Abstract:The wild-type and mutant-type human mitochondrial tRNALeu(UUR) genes were synthesized and transcribed in vitro with T7 RNA polymerase.The kinetic parameters of human mitochondrial leucyl-tRNA synthetase(mtLeuRS) were determined with wild-type and mutant-type human mitochondrial tRNALeu(UUR) respectively.The results show that the value of Km/Kcat of mtLeuRS for the mutant-type tRNALeu(UUR) is 63.9% as compared with the wild-type.Human mitochondrial tRNALeu(UUR) gene A3243G point mutant can remarkably reduce it′s aminoacylation activity,suggesting it would be one of the mechanisms that the mutation could produce such clinical phenotypes.     

大肠杆菌等受体tRNALeu的T7 RNA聚合酶转录

用化学方法合成编码2个大肠杆菌tRNALeu(tRNALeu1和tRNALeu2)的基因和T7启动子,分别克隆到pUC19载体上,并在纯化的T7 RNA聚合酶的体外转录系统中转录出不含修饰核苷酸的tRNALeu.在T7转录体系中,亚精胺对转录有负影响.在最适转录条件下,可以得到有活力的RNA转录物的量是模板DNA的250倍左右.在大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶的催化下,2种经体外转录产生的未修饰等受体tRNALeu(tRNALeu1和tRNALeu2)的亮氨酸接受能力基本相同,但只有从体内纯化对应的tRNALeu的四分之一左右,表明修饰核苷酸在tRNALeu氨酰化过程中起着较为重要但非关键的作用.     

温州地区2型糖尿病患者线粒体DNA 3243、3316位点的突变筛查

为了解浙江省温州地区2型糖尿病病人中线粒体DNA tRNALeu (UUR)基因A3243G及NADH 脱氢酶亚单位1 (ND1)基因G3316A位点突变的发生频率, 并探讨突变与2型糖尿病主要临床指标出现的相关性。对随机收集的无血缘关系的244例温州地区2型糖尿病患者进行研究, 同时选择156例无 DM 家族史的糖耐量正常者作为对照组, 用聚合酶链反应及限制性片段长度多态性分析技术进行点突变筛选, 筛选到的异质性突变样本经T-A克隆后再作测序和变性高效液相色谱(DHPLC)确证。结果在244例的2型糖尿病患者中检出A3243G突变1例(0.410%), 156例对照者中未检出该突变, 突变发生率在两组间差异无统计学意义(P>0.05); 2型糖尿病患者中检出G3316A突变4例(1.639%), 156例对照者中检出突变2例(1. 282%), 突变发生率在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明线粒 体tRNALeu (UUR) 基因A3243G突变在浙江温州2型糖尿病人群中发生频率低, 不是温州人群中2型糖尿病的常见病因。线粒体ND1基因G3316A突变在糖尿病人群中的发生频率也较低, 且在正常人群中也有出现, 可能仅为人群中线粒体DNA的基因多态性。     

节杆菌BT801 N-氨甲酰氨基酸水解酶基因的克隆与表达

通过PCR从质粒pUC18 16 9中扩增得到N 氨甲酰氨基酸水解酶基因 (hyuC) ,置于原核表达载体pQE6 0的T5启动子下游构成表达质粒pQE6 0 hyuC ,并在大肠杆菌M15中实现了该基因的高表达。SDS PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 44kD处有一表达带 ,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的 40 % ,主要以可溶性形式存在。酶活性分析结果表明 ,工程菌M15 pQE6 0 hyuC的N 氨甲酰氨基酸水解酶的比活分别比原始菌株ArthrobacterBT80 1和亚克隆DH5α pUC18 16 9提高了 5 2倍和 72倍。在节杆菌BT80 1和大肠杆菌DH5α pUC18 16 9的反应体系中加入等量菌体的工程菌M15 pQE6 0 hyuC ,可使乙内酰脲酶总比活分别提高 8 1倍和 3 0倍。     

节杆菌BT801 N-氨甲酰氨基酸水解酶基因的克隆与表达

通过PCR从质粒pUC18-169中扩增得到N-氨甲酰氨基酸水解酶基因（hyuC）,置于原核表达载体pQE60的T5启动子下游构成表达质粒pQE60-hyuC,并在大肠杆菌M15中实现了该基因的高表达。SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量44kD处有一表达带,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40%,主要以可溶性形式存在。酶活性分析结果表明,工程菌M15/pQE60-hyuC的N氨甲酰氨基酸水解酶的比活分别比原始菌株Arthrobacter BT801和亚克隆DH5α/pUC18-169提高了52倍和72倍。在节杆菌BT801和大肠杆菌DH5α/pUC18-169的反应体系中加入等量菌体的工程菌M15/pQE60-hyuC,可使乙内酰脲酶总比活分别提高8.1倍和3.0倍。     

嵌合鞭毛蛋白在大肠杆菌BL21(DE3) 和沙门菌SL5928中的表达与组装分析

鞭毛蛋白根据能否组装可以表达为单体或多聚体。目前,关于它们之间的区别少有报道。文中,将重组质粒pET-fliC/M2e2分别导入大肠杆菌BL21(DE3) 和沙门菌SL5928中来表达嵌合鞭毛蛋白mfliC/M和pfliC/M,然后分析它们的组装特性。SDS-PAGE结果表明,两重组菌成功表达了嵌合鞭毛蛋白。透射电镜观察显示,在重组大肠杆菌表面未见鞭毛,而重组沙门菌表面呈现鞭毛。将嵌合蛋白纯化后,圆二色谱 (Circular dichroism,CD) 分析表明,两者的CD信号明显不同,pfliC/M的CD信号与野生型鞭毛蛋白一致,而mfliC/M基本上没有CD信号出现。动态光散射分析表明,mfliC/M的聚集程度明显低于pfliC/M。将嵌合蛋白转染小鼠腹腔细胞3 h后,两者均能诱导产生IL-1β,但mfliC/M组高于pfliC/M组。以上结果对于鞭毛蛋白表达形式的选择具有重要的参考价值。     

葡萄糖脱氢酶高产工程菌的构建及融合蛋白的一步纯化

PCR扩增葡萄糖脱氢酶基因(glucose dehydrogenase, gdh),连接到测序载体pUC19,转化大肠杆菌JM109,测序(GenBank登录号:EF626962)后,亚克隆到表达载体,转化大肠杆菌M15,筛选得到GDH高产工程菌M15/pQE31-gdh8.工程菌经IPTG诱导表达,超声波破碎,粗酶液比活力高达15 U/mg.镍凝胶柱亲和层析纯化表达蛋白,超滤、冻干后,比活力达360 U/mg.重组质粒pQE31-gdh8在E .coli M15中稳定程度高达99.8%.工程菌M15/pQE31-gdh8诱导表达的重组酶活力高,易纯化,重组质粒稳定程度高,具有良好的工业应用前景.     

嵌合鞭毛蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)和沙门菌SL5928中的表达与组装分析（英文）

鞭毛蛋白根据能否组装可以表达为单体或多聚体。目前,关于它们之间的区别少有报道。文中,将重组质粒p ET-fli C/M2e2分别导入大肠杆菌BL21(DE3)和沙门菌SL5928中来表达嵌合鞭毛蛋白mfli C/M和pfli C/M,然后分析它们的组装特性。SDS-PAGE结果表明,两重组菌成功表达了嵌合鞭毛蛋白。透射电镜观察显示,在重组大肠杆菌表面未见鞭毛,而重组沙门菌表面呈现鞭毛。将嵌合蛋白纯化后,圆二色谱(Circular dichroism,CD)分析表明,两者的CD信号明显不同,pfli C/M的CD信号与野生型鞭毛蛋白一致,而mfli C/M基本上没有CD信号出现。动态光散射分析表明,mfli C/M的聚集程度明显低于pfli C/M。将嵌合蛋白转染小鼠腹腔细胞3 h后,两者均能诱导产生IL-1β,但mfli C/M组高于pfli C/M组。以上结果对于鞭毛蛋白表达形式的选择具有重要的参考价值。     

大肠杆菌tRNALeu的基因克隆、高效表达和纯化

用化学法合成的tRNA^Leu 和tRNA^Leu ₂的基因分别连接到 pTrc99B质粒载体上 ,转化到大肠杆菌MT10 2中 .DNA测序筛选得到与已知tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 的基因顺序完全相同的克隆 .对带有tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 基因的 2个转化子 (MT -Leu1和MT- Leu2 )表达条件进行了优化 ,MT- Leu1和MT- Leu2总tRNA中的亮氨酸接受活力分别达到 810 pmol/A2 6 0 和 5 60 pmol/A2 6 0 :tRNA^Leu₁ 占MT -Leu1总tRNA的5 0 % ;tRNA^Leu₂ 占MT- Leu2总tRNA的 3 0 % .经DEAE Sepharose、BD -纤维素层析柱 ,可分别将MT- Leu1和MT -Leu2的总tRNA纯化到 160 0pmol/A2 6 0 .首次准确地测得了 2种等受体tRNALeu的氨酰化反应动力学常数 .     

线粒体基因突变与糖尿病的相关性研究进展

线粒体DNA(mtDNA)突变可引起多种遗传性疾病,其中包括糖尿病.与mtDNA突变相关的糖尿病中最常见的变异是tRNALeu(UUR)] 3243 A→G.文章描述了mtDNA线粒体突变与糖尿病的相关性,介绍了线粒体糖尿病的临床特点和发病机制,概括了线粒体糖尿病相关变异基因位点,重点介绍了m.3243A→G、3310C→T、16189T→C基因突变与线粒体糖尿病病理生理的联系.文章认为mtDNA突变位点的研究为糖尿病的发生机制提供新的视角,也为糖尿病的治疗提供了新方向.     

小鼠原核期受精卵体外培养系统的筛选

为了筛选出最佳的小鼠原核期受精卵的体外发育培养系统,分别进行了四个试验。试验I:在体外分别用自配的M16、mM16、KSOM、mKSOM、CZB进行体外发育培养,进而筛选出一种最佳的体外培养系统;试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别:探讨了血清、PVA、rhLIF对小鼠胚胎发育的影响。结果,试验I中胚胎发育到2-细胞的比率差异不明显,但是在mM16和mKSOM中,发育到4-细胞的比率94.7%,90.7%(91/96;78/86)和发育到桑椹胚/囊胚的比率分别为78.1%,67.4%(75/96;58/86)均明显高于其他三种培养液;试验II用10?S代替M16中BSA时,胚胎的发育率均下降,即使在mM16中桑椹胚/囊胚率仅为4.8%(12/35)与对照组M16(40.5%)差异显著(p<0.05);试验Ⅲ用PVA取代mM16和mKSOM中的BSA其体外发育率显著下降,胚胎均无一例发育到桑椹胚/囊胚;试验Ⅳ:rhLIF能提高胚胎在体外的发育率可使mM16培养的胚胎囊胚率、囊胚脱出率分别达到84%(47/56)、39.2%(22/56)。结论:在不添减其他成分前提下,只在M16中添加0.1mMolEDTA、0.5mMol牛磺酸、1000IU/mlrhLIF便可获得84%的囊胚率,同时证明在M16或mM16添加血清都会降低其体外发育率;PVA还不能有效的取代mM16、mKSOM中的血清。     

禽致病性大肠杆菌IMT5155 疑似毒力基因在人源及动物源大肠杆菌中的分布

[目的]检测禽致病性大肠杆菌IMT5155自分泌黏附素基因等具有代表性的疑似毒力基因在不同来源大肠杆菌中的分布,为进一步研究其致病机理提供依据.[方法]采用PCR和Dot blot,检测疑似毒力基因在不同地区(101株大肠杆菌中国分离株和121株大肠杆菌德国分离株)、不同来源(人源、禽源及猪源)大肠杆菌中的分布,并分析其和大肠杆菌系统进化分群的关系.[结果]自分泌黏附素基因B11等11个疑似毒力基因在禽致病性大肠杆菌中分布率较高,阳性率分别为:A1 36.4%(32/88)、A8 53.4%(47/88)、A1063.6%(56/88)、B1137.5%(33/88)、F3 59.1%(52/88)等,且疑似毒力基因主要存在于大肠杆菌B2进化群中.值得注意的是,D1、E9和F11基因片段在新生儿脑膜炎大肠杆菌中有较高的分布率,分别为60%(6/10)、80%(8/10)和90%(9/10),而在新生儿脑膜炎大肠杆菌中未检测到B11基因.[结论]自分泌黏附素B11等疑似毒力基因与禽致病性大肠杆菌关系密切,但疑似毒力基因D1、E9和F11与新生儿脑膜炎大肠杆菌密切相关,提示禽致病性大肠杆菌可能是新生儿脑膜炎大肠杆菌的毒力基因储库.     

紫色丘陵区玉米/大豆套作系统土壤磷吸附-解吸动力学

利用田间小区试验研究了玉米/大豆套作(M/S)、玉米单作(M)、大豆单作(S)3种栽培模式下施磷对土壤磷吸附解吸特征的影响.结果表明： 在不施磷处理下,M/S系统产量较M、S分别提高9.8%、79.1%,土地当量比为1.58;在施磷处理下,M/S系统产量较M、S分别提高10.4%、80.3%,土地当量比为1.62.与不施磷处理相比,施磷使M/S、M、S 3种栽培模式下的系统总产量分别提高12.7%、12.2%、17.6%.无论施磷与否,3种栽培模式下土壤最大缓冲容量(SBC)值均表现为M/S>M>S;但与施磷处理相比,不施磷处理下M/S、M、S栽培模式下土壤SBC值分别降低19.6%、30.3%、12.0%.各栽培模式在施磷处理下土壤单位吸附量的解吸量b值大小为M/S>M>S;与不施磷处理相比,施磷使M/S、M、S模式下b值分别增加10.9%、39.1%、-9.6%.土壤最大吸磷量(Q_m)及土壤磷解吸率也表现出相同的趋势.     

氨甲酰磷酸不同合成途径在大肠杆菌中的比较

【背景】氨甲酰磷酸是生物合成代谢中精氨酸与嘧啶的重要前体物质,在工业微生物生产精氨酸与嘧啶及其衍生物中发挥关键作用。【目的】在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中比较氨甲酰磷酸不同合成途径的催化效率。【方法】在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中过表达鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)的基础上,分别过表达大肠杆菌自身的氨基甲酸激酶(CK)和氨甲酰磷酸合酶(CPSⅡ)并表征其反应效果。通过优化底物供应(调整底物浓度与引入L-谷氨酰胺合成酶)对CK与CPSⅡ的催化反应进行优化。【结果】在大肠杆菌中过表达OTC,建立细胞水平氨甲酰磷酸检测体系。在此基础上比较不同来源的CK,发现大肠杆菌来源的CK效果最好,50mmol/LNH4HCO3条件下全细胞催化9h得到2.95±0.15mmol/LL-瓜氨酸;过表达CPSⅡ时,50mmol/LL-谷氨酰胺催化9h得到3.16±0.29 mmol/L L-瓜氨酸。通过改变底物NH4HCO3浓度和引入外源L-谷氨酰胺合成酶(GS)等方式对CK与CPSⅡ的催化反应分别进行优化后,100 mmol/L NH4HCO3条件下,L-瓜氨酸浓度分别提高至4.67±0.55mmol/L和6.12±0.38mmol/L,且过表达GS后CPSⅡ途径可以利用NH3,不需要额外添加L-谷氨酰胺。【结论】引入L-谷氨酰胺合成酶后的CPSⅡ途径合成氨甲酰磷酸的能力优于CK途径,为精氨酸、嘧啶及其衍生物的合成提供了一种更加高效的策略。     

医药其它

920561链球菌抗肿瘤蛋白:在大肠杆菌细胞中的表达及其皿组蛋白的特性〔英〕/Kanaoka,M.”·,Agr-ie。Biol.Cbem一1991,55(3)。一743~750〔译自DBA,1991,10(12),。i一067。幻 用质粒pUC19作载体,将链球菌抗肿瘤蛋白SAGP(源千酿脓链球菌(召‘:e夕名oeoee。召尹犷。-g。介。。)Su染色体的Hindl片段)克隆到大肠杆菌 JMio3中。获取重组质粒pSP3i、ptae SPZ和ptac SP3,以便在大肠杆菌中表达SAGP。通过 (NH‘):50‘沉淀、Zx离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC,从5.51大肠杆菌JMio3/质粒ptae SP培养液中纯化重组SAGPt纯度大于90%)。重…     

天冬酰胺酶介导的分枝杆菌酸适应机制

[目的]结核分枝杆菌可以在宿主细胞内的酸性环境中长期存活.为了探明天冬酰胺酶(AnsA)代谢通道介导的分枝杆菌在酸性环境中的适应机制,分别通过体内和体外实验,对AnsA的活性、突变体性质进行了分析.[方法]以无致病性的卡介苗分枝杆菌(M.bovis BCG)为模式菌,扩增天冬酰胺酶编码基因ansA并在大肠杆菌中进行表达和纯化,对AnsA的酶学活性进行了分析.在卡介苗分枝杆菌中将ansA敲除,对其抗酸、产氨等特性进行了研究.[结果]纯化的重组AnsA在体外可以将天冬酰胺分解并产生氨.在酸性培养基中,分枝杆菌利用天冬酰胺产生的氨,可以释放到培养基中,将酸性培养基中和.敲除ansA后,卡介苗分枝杆菌在酸性环境中的生长滞后10天左右.为了更好的理解天冬酰胺介导的抗酸机制,绘制了天冬酰胺代谢、氨产生和转运示意图.[结论]结核分枝杆菌的抗酸特性之一是通过分泌氨将周围的酸性环境中和来实现的.氨来源于分枝杆菌AnsA对底物天冬酰胺的分解.这为揭示结核分枝杆菌在宿主巨噬细胞内酸性环境中的生存机制提供了线索.     

过表达carAB和pyrBI对大肠杆菌发酵胞苷的影响

为了考察氨甲酰磷酸合成酶和天冬氨酸氨甲酰转移酶对大肠杆菌发酵生产胞苷的影响,以E. coli A39 (△cdd)基因组为模板克隆carAB和pyrBI并与载体pSTV28连接构建出重组质粒pSTV28-carAB和pSTV28-pyrBI,将这两个重组质粒分别转入出发菌株A39 (△cdd)后,通过摇瓶发酵研究重组质粒对菌体的生长、胞苷和尿苷产量及副产物乙酸积累的影响。结果显示,工程菌E. coli A39-AB和A39-BI的胞苷产量分别为583.5 mg/L、408.4 mg/L,与出发菌株相比,分别提高了85.3%、29.7%。这说明过表达操纵子基因carAB和pyrBI均可促进胞苷的积累。     

中药大黄的综合研究——Ⅷ.蒽醌衍生物抗菌作用的机制(2)对金黄色葡萄球菌含氮化合物代谢的影响

本实驗初步观察了大黃酸和大黃素对金黄色葡萄球菌核酸与蛋白质的合成,氨氮的同化利用,氨基酸的氧化脫氨和轉氨作用的影响。(1)大黄酸和大黄素对金黃色葡萄球菌在葡萄糖-肉湯培养基中RNA、DNA和蛋白质的合成具有很强的抑制作用。1抑菌单位濃度的大黄酸(15微克/毫升),其抑制百分率分別为90、84和72;大黄素(10微克/毫升)分別为100、100和93。(2)叶酸对大黄素抑制金黄色葡萄球菌核酸的合成有拮抗作用,大黃素在最低抑菌濃度(3.6×10~(-5)M),叶酸濃度为5.6×10~(-4)M时,可使RNA和DNA的合成分別恢复47&和40%。(3)大黄素对金黄色葡萄球菌在含葡萄糖和硫酸銨培养基中氨氮的同化也有抑制作用,在最低抑菌濃度抑制率为92%。(4)大黄素即使高至200微克/毫升的濃度,对金黃色葡萄球菌谷氨酸-丙氨酸轉氨作用的影响不明显。(5)大黄素对金黄色葡萄球菌氨基酸的氧化脫氨具有抑制作用,对谷氨酸和精氨酸的抑制最强,甘氨酸和丙氨酸次之,門冬氨酸和絲氨酸最弱。对耗氧和脫氨的抑制有平行的关系。     

HaSNPV几丁质酶基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达及其产物对Bt杀虫剂的增效作用

为了探索杆状病毒几丁质酶对微生物杀虫剂的增效作用及其利用途径 ,分别在大肠杆菌和昆虫细胞中表达棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒 (HaSNPV)几丁质酶 .用PCR方法扩增出不含N端信号肽编码序列的几丁质酶基因片段 ,并分别克隆至原核表达载体pET2 8a和重组到杆状病毒BactoBac表达系统 ,在大肠杆菌 (E .coli)BL2 1和粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)细胞系Tn 5B1 4中分别进行了表达 .在大肠杆菌中表达量约占细菌总蛋白 15 % ,在昆虫细胞中表达量约占细胞总蛋白10 % .将含有几丁质酶的大肠杆菌和昆虫细胞表达产物添加到苏云金杆菌 (Bt)菌液中一起喂食 2龄家蚕 .结果显示 ,HaSNPV几丁质酶基因的 2种表达产物和Bt杀虫剂的混合物使处理的家蚕的致死时间较对照处理均明显缩短 .昆虫细胞和大肠杆菌表达产物与Bt混合物处理的LT50 分别从 93 5h和 95 1h缩短到 5 6 2h及 6 7 2h ,并且供试家蚕的生长速度明显缓慢 .研究结果表明 ,重组的HaSNPV几丁质酶有望作为Bt杀虫剂的增效剂