靶向IRE1a干扰质粒构建及对ERS时细胞增殖及凋亡的影响

目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA,分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2,依次转染入HeLa细胞和HepG2细胞中。采用RT—PCR检测pS1、pS2转染前后IRE1a在HeLa细胞和HepG2细胞中的mRNA水平,免疫印迹检测pS1、pS2转染前后IRE1a蛋白的表达;MTT比色法、BrdU／DAPI双免疫荧光法及流式细胞仪分别检测各重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。结果干扰质粒（pSUPER-IRE1a）能有效抑制HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a基因的表达;成功转染后,细胞处于内质网应激（ER stress）状态时,各实验组细胞增殖率及凋亡率与对照组比较,差异均具有统计学意义P〈0．05）。结论成功构建靶向人IRE1a的shRNA真核表达载体pS1、pS2,有效抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a的表达;细胞处于ERS状态时,IRE1a-shRNA有效促进HeLa、HepG2两种肿瘤细胞的增殖;抑制HeLa和HepG2细胞的凋亡。     

小分子G蛋白Rap1 shRNA表达载体的构建和鉴定

应用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制Rap1基因的表达,构建RaplshRNA（small hairpin RNA．shRNA）表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中RaplmRNA和蛋白表达的干扰作用．根据小鼠RaplmRNA的全序列．设计了3种Rap1 siRNA序列（Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3）和阴性对照序列（HK）;采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光（EGFP）的pGenesi1－3载体,构建RaplshRNA表达载体：经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致：昆明小鼠40只,体重18～20g,随机分成4组：I组（转染HK组）、Ⅱ组（转染RaplshRNAl组）、Ⅲ组（转染RaplshRNA2组）、Ⅳ组（转染Rap1 shRNA3组）．于0、16、24h腹腔内注射Rap1 shRNA2．0－2．5mg／kg（用PBS稀释至1mL）：48h后收集小鼠肝脏．用显微荧光、定量RT—PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1 shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平．I组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60％．Ⅱ组、m组、Ⅳ组的RaMmRNA表达、Rap1蛋白表达均降低．其中Rao1 shRNA1干扰效果最佳．     

短发夹 RNA 介导 RNA 干扰的时间 和剂量效应研究

用 RNA 干扰 (RNA interference , RNAi) 技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中 RNAi 作用的剂量和时间效应 . 应用 Lipofectamine 2000 将外源报告基因的表达载体与编码短发夹 RNA (short hairpin RNA , shRNA) 的质粒共转染 HEK293H 细胞,观察 shRNA 载体对报告基因的抑制效应 . 转染后, shRNAs 的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达 . 在共转染后 12 , 24 , 48 , 60 , 72 , 96 h 时检测 EGFP (enhanced green fluorescent protein , EGFP) 基因 mRNA 及蛋白质表达水平,结果显示, EGFP mRNA 及蛋白质表达在 12 h 时略有降低, 24~48 h 时表达逐渐降低, 48~72 h 时降低最明显,其后 EGFP 表达水平逐渐恢复 . 提示该过程中 RNAi 效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势 . 共转染一系列剂量比例的 EGFP 干扰载体与靶载体的结果表明,在一定剂量范围内, RNA 干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关,当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时,抑制效应则维持在一“平台期” . 此外,通过 RNAi 抑制 HeLa 细胞、 HEK293 细胞中荧光素酶基因的表达, 荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应 . 这些结果表明,在体外哺乳动物细胞中,基于表达载体的 RNAi 作用呈现剂量和时间依赖性效应 . 这为基于载体表达的 RNAi 技术应用研究提供了一定的理论参考及依据 .     

SGK3基因RNAi慢病毒载体的构建及其对乳腺癌MB-474细胞增殖和凋亡的影响

旨在构建SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MB-474增殖和凋亡的影响。构建靶向SGK3的shRNA序列慢病毒载体,将其转染至人乳腺癌MB-474细胞以沉默SGK3基因,Real-time PCR、Western bloting方法检测MB-474细胞SGK3 mRNA及蛋白表达,MTT法和流式细胞术检测SGK3基因沉默对MB-474细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。测序结果显示,成功构建4组SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,经293T细胞包装,病毒滴度为(3-8)×108 TU/m L;将慢病毒转染MB-474细胞后,Real-time PCR、Western bloting结果显示,干扰组SGK3的表达水平较对照组均降低,且PGC-LV3-SGK3-1序列对其干扰效果最佳,SGK3基因沉默可抑制MB-474细胞增殖、促进凋亡,但其对细胞周期进程无明显影响。成功构建靶向SGK3基因的RNAi慢病毒载体,SGK3基因沉默可影响乳腺癌细胞增殖和凋亡等生物学行为。     

B19病毒XA株VP1独特区真核表达系统的建立及鉴定

目的:克隆B19病毒XA株VP1u基因,构建真核重组表达载体.方法:从已构建好的B19病毒XA株原核表达载体中获得VP1u基因,将其克隆入真核表达载体plRES2-EGFP中,经酶切鉴定并测序验证后,获得真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u.将其转染至HeLa细胞,提取细胞总蛋白,用Western blot技术检测VP1u蛋白的表达.结果:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u,荧光显微镜下可见pIRES2-EGFP-VP1u转染HeLa细胞后表达EGFP蛋白而发出绿色荧光,Western blot证明VP1u蛋白在HeLa细胞中表达.结论:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u并在HeLa细胞中正确表达,为今后B19病毒VP1u基因疫苗的研究奠定基础.     

RNA干扰Ezrin体外对肾癌细胞株786-0增殖、凋亡的影响

目的：构建膜- 细胞骨架联接蛋白Ezrin 基因特异性短发卡RAN 表达载体（small hairpin RNA,shRNA）,探讨其对肾癌细胞株786-0 细胞凋亡、增殖的影响。方法：以Ezrin 为靶基因,以Pgenesil-1 质粒为载体,设计和构建重组体,设计2 条发夹式RNA（shRNA）,合成后克隆入载体Pgenesil-1,扩增并中量提取质粒,应用脂质体Lipofectamine 2000 转染进786-0 细胞,重组质粒转染786-0 肾癌细胞株,用运实时荧光定量PCR 进行筛选鉴定,筛选出抑制率较高的重组质粒载体shRNA-Ezrin1,用shRNA-Ezrin1转染786-0 细胞,采用MTT、流式细胞仪、电镜检测,观察RNA干扰Ezrin 后肾癌细胞株786-0 细胞增殖能力的改变。结果：shRNA干扰后786-0 细胞增殖活性减弱,G0/G1时段明显延长（P〈0.01）,PI缩短（P〈0.01）,细胞凋亡率增加（P〈0.01）。结论：Ezrin与肾癌细胞凋亡、增殖有关,有望成为肾癌基因治疗的一个新靶点。     

SPARC基因过表达对SKM-1细胞凋亡的影响

构建SPARc基因过表达载体,转染人骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）-u／胞系SKM-1细胞,探讨SPARc基因过表达对!＆MDS细胞系SKM一1细胞凋亡的影响。XpcD—NA．SPARC为引物,PCR扩增SPARc基因;将靶基因克隆入慢病毒载体pGC—GV,构建含有删Rc基因的重组慢病毒载体pGC—GV-SPARC,测序检测正确性;将构建载体pGC-GV-5黝尺C砗专染人MDs细胞系SKM-1,流式细胞术检测转染效率,RT-PCR检测sKM-1细胞中SPARCmRNA表达,Westernblot检测SPARC蛋白表达,MTS法测定小剂量阿糖胞苷（30ng／mL）对实验组增殖抑制的影响,AnnexinV检测．洲尺c基因转染后对人SKM-1细胞凋亡的影响。结果显示,构建含有SPARc基因的重组慢病毒载体pGC-GV-SPARC转染效率为（64．25±1．42）％;转染后,SPARCmRNA及蛋白表达在靶细胞中较对照组增多。小剂量阿糖胞苷对转染组的增殖抑制率明显高于其他组。SPARC基因转染后人SKM-1细胞凋亡率较未转染组明显增高,加入阿糖胞苷后人SKM-1细胞凋亡率较对照组明显增高。由此说明,作者成功构建了携带．＆SPARc基因的慢病毒载体,转染．NSKM-1细胞系后稳定表达SPARC基因,SPARC过表达可抑制细胞增殖,且联合小剂量阿糖胞苷（30ng／mL）更有效地抑制SKM-1细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

鸡源细胞基因沉默及快速筛选的实用型双标记RNAi载体

利用人H1 RNA启动子、EGFP基因及Neomycin抗性基因,构建用于禽类细胞基因持续沉默和快速筛选的实用型RNAi载体。在将pCDNA3.1(+)载体上的SV40启动子替换为鸡源的β-actin启动子后,装入EGFP基因表达框以及用于驱动外源shRNA转录的人H1 RNA启动子,构建成同时具有EGFP和Neomycin抗性双标记的RNAi载体,并为载体引入独特设计的含媒介序列的多克隆位点以方便外源shRNA编码小片断插入后的快速筛选,载体设计非常实用。插入靶向EGFP和sIgM λ基因的shRNA编码序列后分别瞬时转染DF-1和DT40细胞,结果显示靶基因表达得到了明显抑制。联用EGFP和Neomycin双标记快速筛选sIgM λ轻链基因稳定沉默的DT40细胞克隆的结果也证实,H1启动子转录shRNA的干扰效果是高效的,双标记筛选策略不仅有效而且方便、快捷。     

利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。     

DLC-1基因表达对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响

目的:研究DLC-1基因对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响.方法:将DLC-1 shRNA(短发夹状RNA,short hairpin RNA)序列克隆到质粒pGCsi-U6/Neo载体,采用脂质体介导的转染方法将构建的DLC-1 shRNA表达质粒转入结肠癌细胞系LoVo细胞.采用RT-PCR技术和Western Blot技术分别检测LoVo细胞中DLC-1mRNA和蛋白表达水平的变化.Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验观察LoVo细胞侵袭迁移能力的改变.结果:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1分子.所构建质粒表达载体能有效地干扰LoVo细胞DLC-1 mRNA和蛋白质表达水平;Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验结果显示,转染后LoVo细胞侵袭转移能力明显增强(p＜0.05).结论:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1基因,应用RNAi技术可特异性降低其表达.DLC-1的表达水平与结肠癌细胞侵袭转移相关.     

AKT2 基因短发夹结构RNA 慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建丝/苏氨酸蛋白激酶2（AKT2）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法：利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果：成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论：成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

HSP27 特异性shRNA 表达载体的构建及在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株 SW1990/Gem 中的表达

目的:构建HSP27基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体及观察其在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem中的表达,为进一步探索肿瘤的基因治疗打下前期基础。方法:参考文献及shRNA设计原则,设计并合成2条能转录shRNA的DNA序列,退火连接后,插入含绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNAT-shHSP27。重组载体经鉴定后转染SW1990/Gem,倒置荧光显微镜观察转染情况,RT-PCR、Western Blot从mRNA及蛋白水平探讨转染对耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem的影响。结果:成功构建了针对HSP27基因的shRNA表达载体。倒置荧光显微镜下显示转染48h后SW1990/Gem细胞内存在GFP表达。RT-PCR、WesternBlot结果提示转染后HSP27的mRNA及蛋白表达水平较对照组有明显抑制(P<0.05)。结论:成功构建针对HSP27基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制HSP27表达,为进一步研究HSP27与胰腺癌生物学行为及化疗耐药等相关性奠定了基础。     

Multiple shRNA-mediated knockdown of TACE reduces the malignancy of HeLa cells

Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) converting enzyme (TACE) is a key enzyme involved in the proteolytic shedding of the ectodomain of several membrane-bound growth factors, cytokines and receptors. Here, we constructed a multiple short hairpin RNA (shRNA) expression vector containing four shRNAs against TACE. We found that in HeLa cells our multiple shRNAs vector produced a higher level of TACE knockdown than any single shRNA vector containing only one TACE shRNA. Silencing TACE expression in HeLa cells decreased their malignancy by decreasing the proliferation, adhesion and migration, as well as inducing apoptosis in these cells. Furthermore, our data suggest that the effects of TACE on the malignancy of HeLa cells may be mediated via activation of the EGFR (epidermal growth factor receptor) signaling pathway. Our findings suggest that using a combination of shRNAs within one vector to silence the expression of TACE might be a potential therapeutic strategy for tumors.     

FXYD6 shRNA表达载体的构建及其在体外对胰腺癌细胞增殖的影响

目的：构建FXYD6短发夹RNA（shRNA）表达载体,体外评价其对胰腺癌细胞sw1990的增殖与FXYD6蛋白表达的抑制效果。方法：基于microRNA mir-30天然结构,设计表达4对FXYD6 shRNA的互补DNA序列,克隆入pCGM30质粒载体,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,PCR法筛选阳性克隆,经酶切和基因测序鉴定;利用LipofectAMINE2000将pCGM30-FXYD6shRNA转染至胰腺癌细胞sw1990,MTT法检测转染后胰腺癌细胞增殖的变化,Western blot检测胰腺癌细胞中FXYD6蛋白表达水平的变化。结果：设计合成了4对表达FXYD6 shRNA的互补DNA序列,构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒;基因测序证实shRNA编码序列与设计的片段完全一致,酶切鉴定证实载体构建成功;体外实验表明,转染胰腺癌细胞sw1990的增殖能力和FXYD6蛋白表达水平明显降低（P〈0．05）,FXYD6蛋白表达水平随时间延长逐渐降低（P〈O．01）,但细胞增殖能力无明显变化（P〉0．05）。结论：构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒载体,可有效抑制FXYD6的表达;抑制胰腺癌细胞sw1990中FXYD6的表达可以抑制细胞的增殖,提示FXYD6可能是一个具有潜在临床应用价值的基因治疗靶点。     

Silencing of antiapoptotic survivin gene by multiple approaches of RNA interference technology

Silencing of mammalian gene expression by RNA interference (RNAi) technology can be achieved using small interfering RNA (siRNA) or short hairpin RNA (shRNA). However, the relative effectiveness of these two approaches is not known. It is also not clear whether gene-specific shRNA transcribed from an RNA polymerase II (Pol II)-directed promoter in a fusion form can disrupt the targeted gene expression. Here, we report that using both luciferase and antiapoptotic survivin genes as targets, both siRNA and shRNA approaches significantly silenced the targeted gene expression in cancer cells. We further demonstrated that shRNAs transcribed from an RNA Pol II-mediated promoter in a green fluorescent protein (GFP) fusion form at the 3'-untranslated region silenced luciferase and survivin expression as well, suggesting that the extra RNA sequence outside of the shRNA hairpin does not disrupt shRNA function. We also showed that silencing of survivin expression selectively induces apoptosis in transfected cells. Together, we have validated multiple approaches of RNAi technology using both survivin and luciferase genes as targets and demonstrated for the first time that GFP-shRNAs transcribed from an RNA Pol II-mediated promoter could mediate gene silencing, which may lead to new directions for the application of RNAi technology.     

慢病毒载体介导的层黏连蛋白受体稳定抑制细胞株的建立

目的:构建靶向层黏连蛋白受体(LR)基因的小发卡RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,鉴定其对LR的抑制效果,并筛选LR稳定抑制的He La细胞株。方法:设计针对LR的sh RNA序列,将此序列和H1启动子克隆入含有EGFP报告基因的p Lenti6/v5慢病毒表达载体,通过病毒包装、细胞感染、抗生素筛选获得稳定细胞株,用real-time PCR和Western印迹检测筛选得到的稳定细胞株中LR的表达水平。结果和结论:构建了含有LR靶向sh RNA的慢病毒表达载体,包装成病毒后感染He La细胞,经抗生素筛选后获得了稳定抑制LR的细胞株;筛选后的细胞均可观察到报告基因EGFP的表达;经m RNA和蛋白水平检测,LR-sh6和LR-sh7均可显著抑制He La细胞株中LR的表达。