肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的PCR法鉴定

肺炎链球菌是一种致病率和致死率很高的病原菌 ,若无丰富临床检测经验从临床标准中分离鉴定此菌较困难 ,本实验以寡核苷酸引物YH1 YH2、YH7 YH8分别扩增肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,通过改变各种反应条件 ,建立了这两种病原因子基因的PCR检测方法。用此方法对 2 0株肺炎链球菌标准菌株及 7株对照菌株进行了鉴定 ;其扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和和AccI进行酶切以确认扩增产物是否正确 ;用酚 氯仿抽提纯化的全细胞DNA对PCR方法的检测灵敏度进行了测定 ;并利用此方法对 2 8份临床标本分离物进行了鉴定。结果　所有 2 0株肺炎链球菌均可分别用引物YH1 YH2、YH7 YH8扩增出 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,而对照菌株均呈阴性 ;自溶素及溶血素基因的扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和AccI消化后产生的片段和预期的完全一致 ;两对产物均可从 10fg的全细胞DNA中扩增出目的DNA片段。所建立的两套PCR系统对 2 8份临床标本分离物进行鉴定 ,其中PCR阳性的 15份分离物经生化学特性检查被鉴定为肺炎链球菌。本试验所建立的两套PCR检测系统具有特异性强 ,灵敏度高及操作简单等优点 ,均可用于肺炎链球菌的鉴定。     

肺炎链球菌自溶素LytA小片段免疫活性的研究

通过对肺炎链球菌(ATCC49619)自溶素lytA全序列基因的克隆和表达,获得部分小片段蛋白,初步研究其免疫活性。根据GenBank中肺炎链球菌M66菌株lytA基因序列(FN549899.1)设计合成特异性引物,采用PCR技术从肺炎链球菌(ATCC49619)基因组中扩增lytA全序列片段,构建克隆载体PGM-T/lytA,测序后与M66菌株比对显示,肺炎链球菌ATCC49619株碱基序列内存在新酶切位点BamHⅠ。以BamHⅠ、HindⅢ双酶切后,目的基因出现2个小片度,以约500 bp小片段构建重组表达载体pET32a(+)/lytA',经IPTG诱导后等电点洗脱法获取纯化的目的蛋白LytA'。将LytA'免疫小鼠,测定抗体效价,同时进行Western blot鉴定。测序显示肺炎链球菌ATCC49619菌株与M66菌株的lytA全基因序列同源性为98%,具有高度保守性,碱基不同主要位于下游部分,在444~450 bp之间新出现BamHⅠ酶切位点。构建的小片段重组表达质粒pET32a(+)/lytA'在BL21(DE3)中高效表达,获得纯化蛋白LytA',免疫BALB/c小鼠产生的抗体效价为132,经Western blot证实该蛋白具有较好的抗体结合活性,为进一步应用于疫苗及药物等相关研究奠定基础。     

肺炎链球菌溶血素的研究进展

肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,PLY)是肺炎链球菌的一种重要毒力因子,包含4个结构域,是胆固醇依赖性细胞溶血素(CDCs)的家族成员之一。PLY可广泛作用于宿主组织细胞,发挥细胞毒性作用。PLY可活化补体经典途径,诱导巨噬细胞和单核细胞等产生细胞因子,介导机体免疫应答过程。PLY是肺炎链球菌蛋白疫苗和相关小分子药物研制的重要靶标。本文就PLY的结构、功能及相关疫苗的最新研究进展进行综述。     

一种减毒肺炎链球菌溶血素突变体的构建与表达

目的使用重叠PCR方法构建构建△Al46Ply突变体,原核可溶性表达△Al46Ply蛋白,并明确其毒力变化情况;分析肺炎链球菌溶血素（pneumolysin,Ply）在不同血清型肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae,SPN）中的表达情况。方法以SPND39型基因组DNA为模板设计合成构建突变体pry基因所需引物;利用重叠PCR方法扩增合成△Al46ply突变体。通过溶血实验分析其溶血活性,利用中和试验验证△A146Ply诱导产生的特异性抗体中和野生Ply毒素溶血能力,并利用Western印迹检测5株不同血清型肺炎链球菌流行菌株中Ply蛋白表达情况。结果突变体基因测序结果显示,Plyl46位密码子GCT3个碱基被缺失,△Al46ply突变体构建成功,并实现了△Al46Ply的可溶性表达,得到纯度〉90％的重组蛋白。△A146Ply蛋白浓度为100000ng／ml亦未表现出溶血活性。△Al46Ply蛋白诱导产生的特异性抗体能够中和野生Ply毒素的溶血活性。Western印迹结果显示,△Al46Ply诱导产生的多克隆抗体可与国内临床常见4株肺炎链球菌有交叉反应。结论△Al46Ply蛋白是一种安全的肺炎链球菌疫苗候选分子,可刺激机体产生具有中和作用的特异性抗体。     

肺炎链球菌溶血素衍生物PlyD1的安全性和免疫原性

背景：基于保守蛋白抗原的肺炎球菌疫苗具有提供扩大的抵抗肺炎链球菌的保护作用的潜力。     

肺炎链球菌相关溶血尿毒综合征1例

阐述儿童肺炎链球菌相关溶血尿毒综合征的临床表现、诊断及治疗方法。

回顾性分析1例儿童肺炎链球菌相关溶血尿毒综合征患儿的临床表现、实验室检验、影像学检查、治疗经过及随访结果, 并以“肺炎链球菌相关溶血尿毒综合征”“Streptococcus pneumoniae-associated hemolytic-uremic syndrome”作为关键词检索国内外文献并进行复习。

患儿为男性, 3岁零5个月, 以发热、咳嗽起病, 有肺炎合并脓胸、胸腔积液, 胸腔积液行肺炎链球菌抗原检测为阳性, 胸腔积液行第二代测序结果为肺炎链球菌, 行血浆置换治疗病情好转, 3 d内血小板恢复, 血尿素氮及肌酐水平在8 d内恢复正常。随访3个月, 病情稳定, 无肾脏损害表现。

儿童重症肺炎合并胸腔积液患者当出现急性溶血性贫血、急性肾衰竭、血小板下降等表现时, 应考虑到肺炎链球菌相关溶血尿毒综合征的可能, 一旦确诊, 应及时采用血浆置换治疗, 效果显著, 预后良好。

     

化脓性链球菌溶血素O活性结构重组蛋白的制备

生物信息分析化脓性链球菌溶血素O(streptolysin O,Slo)蛋白结构表明,Slo蛋白除含有由461氨基酸残基组成的溶血活性结构域Thiol_cytolysin外,在N端还有一跨膜结构域。利用pET101-GENE蛋白表达系统,成功构建出表达具有Slo活性重组蛋白的重组子,采用镍柱亲和层析分离技术,纯化目的蛋白;纯化蛋白SDS-PAGE检测分析表明,重组蛋白与预测的溶血活性结构域的分子量相一致;溶血实验显示,纯化重组蛋白具有溶血活性。以纯化的重组蛋白为免疫原,对大鼠进行4次免疫,所获得免疫血清经 Elisa检测,抗Slo血清效价达到 1 ∶12 800;Western blot检测猪链球菌、马链球菌和化脓性链球菌中的链球菌溶血素结果显示,抗Slo多克隆抗体仅能与化脓性链球菌溶血素O发生反应,表明研究制备的化脓性链球菌溶血素O活性结构重组蛋白抗原具有较好的特异性,所制备的抗原Slo 可用于进一步开发抗链球菌溶血素O(ASO)试剂盒。     

人—人杂交瘤:分泌抗链球菌溶血素O单克隆抗体细胞株的建立

用人骨髓瘤细胞株和人脾脏细胞在PEG促进下进行人—人杂交,育选出能分泌抗链球菌溶血素O单克隆抗体杂交瘤S_1—19和S_1—22两株,共传了50多代,历时五个月,单克隆抗体分泌稳定,抗体为IgG型,杂交瘤染色体为68—76条而亲代细胞株仅为43条,证实杂交瘤是成功的。     

链球菌溶血素“O”纯化的研究

乙型链球菌３２１７２ 株接种于含有月示蛋白胨的牛肉水培养基中培养。得到含有溶血素“Ｏ”的培养液，其溶血效价２５６ ＩＵ／ｍ ｌ。比活为１１．６ ＩＵ／ｍ ｇ 蛋白。经过超滤除去９５％ 的非目的蛋白，所得超滤截留液的溶血效价为２０４８ ＩＵ／ｍ ｌ，比活为３３５．７ ＩＵ／ｍ ｇ 蛋白。在此基础上用离子交换柱层析纯化，所得活性峰溶血效价为８１９２ ＩＵ／ｍ ｌ，比活为４３１１．５ ＩＵ／ｍ ｇ 蛋白。通过以上两步的分级纯化，溶血素“Ｏ”的比活提高了３７１ 倍。此纯化蛋白在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳中呈现一条染色带。     

葡萄球菌自溶素的研究进展

葡萄球菌是人和动物皮肤黏膜的专性寄生菌,目前临床常见的致病菌种主要有金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。金黄色葡萄球菌可引起局部化脓感染,也可引起败血症、脓毒血症等全身感染。表皮葡萄球菌主要引起心内膜炎、败血症等,     

肺炎链球菌疫苗的研究进展

肺炎链球菌疫苗研制对于肺炎链球菌感染的防治具有重要意义。常见的荚膜多糖疫苗存在很大缺陷,需要更为有效的疫苗来替代。本文综述肺炎链球菌疫苗研制中的一些进展,包括结合疫苗的研制、几种公认的蛋白疫苗因子的研究进展和新的蛋白疫苗因子的筛选。同时还介绍肺炎链球菌疫苗研制过程中的一些新思路（联合疫苗、活疫苗、DNA疫苗）,它们是对肺炎链球菌疫苗研制方法的丰富。     

肺炎链球菌溶血素黏膜免疫抗定植保护作用的研究

目的原核表达△A146Ply蛋白,评价△A146Ply黏膜免疫对肺炎链球菌（Streptococcuspneumon—ioe,5．Pn）在宿主鼻咽部定植的保护作用。方法IPTG诱导、Ni—NTA树脂纯化获得纯化的△A146Ply蛋白,经黏膜免疫BALB／C小鼠,制备其特异性抗血清;进行体内抗定植实验,观察小鼠鼻咽部灌洗液和肺部残存的细菌数量,检测△A146Ply黏膜免疫对19F型肺炎链球菌在鼻咽部定植的保护作用。为验证该保护作用是否具有广谱性,培养血清型14型、3型、6型和2型S．pn,经鼻腔感染免疫后小鼠,评价△A146Ply蛋白黏膜免疫对多株肺炎链球菌定植的保护作用。进行体外抗黏附实验,检测△A146Ply蛋白及其抗血清是否对无荚膜的肺炎链球菌R6黏附A549细胞具有抑制作用。结果获得了纯度〉90％的目的蛋白;体内实验结果显示,△A146Ply黏膜免疫可以显著降低肺炎链球菌19F在宿主鼻咽部和肺部残存的细菌数量（P〈0．01）;14型和3型肺炎链球菌在免疫后小鼠鼻咽部及肺部定植的数量均显著下降（P〈0．05）,2型肺炎链球菌在免疫后小鼠肺部定植的数量显著下降（P〈0．05）,6B型肺炎链球菌在免疫组与对照组小鼠鼻咽部及肺部均无显著差异（P〉0．05）;△A146Ply特异性抗血清△A146Ply蛋白对R6黏附A549细胞的抑制效应呈剂量依赖性。结论△A146Ply蛋白经黏膜免疫BALB／C小鼠可以对多种血清型的肺炎链球菌在宿主鼻咽部及肺部的定植提供显著保护作用,为Ply作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的应用提供了实验依据。     

分泌人源性抗链球菌溶血素O单克隆抗体人—人杂交瘤细胞株的建立

自从淋巴细胞杂交瘤1975年创立以来（Kohler et al.,1975）越来越显示其优越性,（Sikora et al.,1982）,从其发展看来,前景广阔,针对恶性肿瘤,白血病和组织移植等提出了崭新的疗法。由于鼠源性单克隆抗体在临床应用上往往引起过敏反应和形成免疫复合物的危险性,激励着科学家们去开拓人—人杂交瘤,尽管前进的道路上还存在着许多困难,但人们还是不屈不挠地前进。目前,世界上共有三个人—人杂交瘤系统。（1）0lsson和Kaplan等培育的SKO—007人骨髓瘤细胞系统。（2）Croce等培育的GM 1500细胞系统。（3）Clark等的RPMI8226细胞系统。并且都进行了人—人杂交瘤的研究,但是多数杂交瘤阳性率低和分泌抗体量少。国内北京、上海、西安和昆明等都正在开展本项研究。我们从1984年8月,开始人单抗的研究,也碰到许多困难,深深体会到建立一个具有我国特色的人—人杂交瘤系统是十分重要的,现将我们的工作简要报告如下。     

副溶血弧菌海产品和临床分离株的表型及溶血素相关基因分析

副溶血弧菌是(Vibrio parahaemolyticus)常见的食源性病原菌,可污染多种水产品,并引起人的食物中毒,其致病性与溶血素密切相关,如直接耐热溶血素(TDH)、TDH-相关溶血素(TRH)、不耐热溶血素(TLH)。用PCR方法对分离自浙江省部分地区的副溶血弧菌临床和海产品分离株的3种溶血素基因进行检测。结果表明,所有副溶血弧菌菌株均可检测到tlh基因;11株临床分离株均检测到tdh基因,而42株水产品分离株中只有1株检出tdh基因,携带tdh的分离株神奈川试验(KP)均为阳性。所有分离菌株中均未检测到trh基因以及其尿素酶试验呈阴性,由此可知trh基因可能与尿素酶基因连锁。副溶血弧菌分离株中致病性相关毒力因子TDH的阳性率极低,然而副溶血弧菌性食物中毒发生率较高,它们之间的关系及其发病机制还有待深入研究。     

肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)的研究进展

肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)是各型肺炎链球菌共有的种特异性表面结合脂蛋白,具有较好的免疫原性,在肺炎链球菌黏附呼吸道粘膜过程中起关键作用,PsaA的编码基因psaA在遗传上高度保守,PsaA是目前肺炎链球菌抗原研究的热点之一。本文就十年来PsaA的研究进展作一简要综述。     

肺炎链球菌血清型鉴定和分子鉴定方法研究进展

肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,SP)通常又称为肺炎球菌,是肺炎、脑膜炎和其他侵入性疾病的主要病原菌,同时也是造成5岁以下儿童高发病率和死亡率的最常见的病原菌.准确鉴定出SP的血清型,对于肺炎球菌性疾病的诊治具有重要的意义.在我国,由于实验室检测水平在不同地区、医院及科室间差异较大以及表型检...