流行性乙型脑炎减毒株的研究进展

本文介绍了流行性乙型脑炎病毒株的研究简史,并着重阐述了现用减毒活疫苗株ＳＡ_（１４）－１４－２的生物学特点、分子生物学、免疫效果及其机理。     

乙型脑炎减毒活疫苗恒河猴免疫实验

恒河猴与人同属灵长类动物,对流行性乙型脑炎(乙脑)病毒感染都能产生病毒血症和抗体应答。我们曾用在地鼠肾细胞传代的乙脑减毒53株疫苗,及其鸡53疫苗(即原53株在     

乙型脑炎减毒活疫苗走向世界——WHO版本的乙型脑炎减毒活疫苗制检规程正式发表

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的感染主要引起中枢神经系统损害,是病毒性脑炎最严重的一种。目前仍然是许多亚洲国家的一种严重传染病,年发病率高达10／10万,病死率为25％,发病最高的为儿童和老人,并常伴有严重的神经系统后遗症。     

利用流行性乙型脑炎病毒减毒株脑细胞吸附特征快速筛选减毒株的初步研究

实验证明,流行性乙型脑炎病毒减毒株的脑细胞吸附能力明显低于强毒株。据此,我们发展建立了一种从强毒SA14株中快速、简便地筛选减毒株的新方法。将3周鼠脑细胞37℃吸附SA14株1小时,从未吸附的病毒颗粒中挑出3个减毒株(C4、C5和B1)。将C5株再次吸附筛选,得到C563株。C563株已完全丧失对3周鼠的脑内毒力和皮下毒力,免疫小鼠一针即能诱导良好的抗体反应和保护力,经BHK21细胞盲传5代或乳鼠脑传一代,毒力没有明显回升。     

流行性乙型脑炎活疫苗细胞免疫检测方法的探索

本文建立了流行性乙型脑炎活疫苗细胞免疫检测方法。采用纯系Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ－２ｄ）小鼠制备效应细胞,以同一品系Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ－２ｄ）小鼠原代肾细胞为靶细胞。当效靶细胞比例为２０∶１,杀伤时间为４小时,ＭＴＴ反应时间为４小时,细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用最强。利用该法对乙脑活苗和死苗免疫小鼠进行了ＣＴＬ活性测定,结果表明该法重复性好,活苗诱导ＣＴＬ杀伤作用强于死苗     

冻干乙型脑炎减毒活疫苗的冻干工艺优化研究

为了研究优化冻干乙型脑炎减毒活疫苗的冻干工艺,运用正交试验法L934考察不同冻干参数对该疫苗成品质量的影响,以外观、残余水分、病毒滴度以及热稳定性为直观分析指标,并对病毒滴度进行方差分析。结果显示,主干燥时间和主干燥真空压力对病毒滴度的影响有显著统计学意义(P<0.05)。优化的冻干参数为预冻温度-35℃、时间2h;主干燥温度从-35℃升温至-10℃,再由-10℃升温至33℃,总耗时16h,真空压力0.220mbar;二次干燥的温度维持于30℃,真空压力为0.001mbar,终点测试压力无变化时结束。对冻干乙型脑炎减毒活疫苗冻干参数筛选优化后,可得到较佳的冻干曲线,经验证该曲线适用于生产。     

幼驹获得的母体抗体及其对乙型脑炎活疫苗免疫的影响

1．幼驹能从乙脑活疫苗免疫的母马,获得先天性中和抗体。出生后1—3日采取的幼驹血清内中和抗体强度相当高,82．1％幼驹的血清中和指数达1,000以上。此种抗体随幼驹成长而逐步降低,但可持续4—5个月或更久。 2．幼驹从母体获得的被动性抗体,能抑制活疫曲免疫引起的免疫反应;而马匹自然获得的自动性抗体,对活疫苗的免疫反应却无抑制作用。 3．对先天性抵抗力的机制、先天性被动免疫从母体传递至子体的途径、先天性被动免疫对话疫苗负疫的影响,进行了讨论。     

乙型脑炎病毒野毒株及其不同株减毒株E蛋白基因序列比较

为了解乙脑减毒活疫苗株SA14 14 2的神经毒力减毒机制 ,用RT PCR方法分别扩增不同减毒程度毒株的E基因 ,克隆、测序 ,继而对各毒株序列进行比较。结果表明SA14 强毒株与SA14 12 1 7株间只有 3个氨基酸发生改变 (E 10 7,E 176 ,E 4 39) ,SA14 12 1 7与SA14 9 7和SA14 5 3株间有另 3个氨基酸发生改变 (E 138,E 2 79,E 315 )。SA14 9 7株与SA14 5 3株只有一个核苷酸NT 4 0 5不同 ,但未引起氨基酸改变。SA14 14 2疫苗株除保留SA14 12 1 7和SA14 9 7所改变的 6个氨基酸外 ,另有 2个氨基酸发生了改变 (E 177,E 2 6 4 ) ,共计在E区共发生 8个氨基酸的替代。SA14 12 1 7株的低神经毒力很不稳定而其余各株的弱毒特征很稳定。因此 ,E 176 (Ile→Val) ,E 4 39(Lys→Arg)和E 10 7(Leu→Phe)可能与神经外和神经内毒力减弱有关。E 138(Gul→Lys) ,E 315 (Ala→Val)和E 2 79(Lys→Met)的突变可能与神经毒力的减弱和稳定性相关     

乙型脑炎14-2株冻干活疫苗的生产研究

乙型脑炎病毒14-2株经地鼠肾细胞连续传23代,各代次的病毒滴度和回传乳鼠后的毒力都较稳定,与5-3株无差异。各代次的神经毒力和中枢神经外毒力也与5-3株相同。脑内感染12～14克小白鼠均不致死,皮下感染也不致病。用地鼠肾细胞经36℃培养4天,病毒增殖达到高峰,滴度为8.0～8.5logTCID50/0.2ml。病毒培养液的pH值为7.4～7.6时,病毒增殖高峰可持续3天。以1％明胶、5％蔗糖为保护剂,在冻干后无真空、不充氮的条件下。14—2株活疫苗在37℃可保存10天,室温(16～31℃)可保存4个月,5～8℃可保存一年,病毒滴度均无明显下降.冻干后充氮或不充氮病毒的滴度及稳定性看不出差异。冻干14—2株活疫苗融化后,用Eagle’s液稀释,置22～23℃8小时,滴度不变,若以生理盐水稀释,则可保持2～4小时;以蒸馏水稀释只能稳定2小时。     

流行性乙型脑炎病毒减毒株免疫仔猪血清学反应和流行病学保护

1. 用乙脑病毒的减毒株C株和强毒株P,株免疫仔猪,接种P,株后48和72小时从仔猪血液中可检出病毒,用C株免疫的动物,检查病毒血症全属阴性。 2. 免疫前后检查和比较血清抗体的结果是：用P3株免疫的两只仔猪,免疫后抗体比免疫前明显增长;用C株疫苗10毫升和1.0毫升各免疫6只的两组动物中,免疫后分别有5只和2只抗体明显增长;接受灭活疫苗的6只动物,抗体全未增长。 3. 比较各组动物免疫前后血清抗体水平(见表2)还发现,对照组和灭活疫苗组内各有两只、C株疫苗10毫升免疫组内有一只动物,免疫后较免疫前的抗体水平反而有所降低。此种降低显然是母体被动抗体水平随年龄增大而下降的表现。 4. 在乙脑流行季节,从各组动物体内连续采取血管末梢血液,分离自然界散布的野生乙脑病毒,以观察流行病学保护效果。从对照组动物10只中有5只、灭活疫苗组6只中的2只分离到了野生乙脑病毒;而在用c株免疫的两组共12只,用P|株免疫的2只中,没有得到乙脑病毒。这些数据可以说明,C株病毒可用于免疫仔猪以防止自然界乙脑病毒造成的病毒血症,使用剂量小到1．0毫升仍有效。     

乙型脑炎病毒野毒株及其不同株减毒株E蛋白基因序列比较

为了解乙脑减毒活疫苗株SA14-12-1-7的神经毒力减毒机 制,用RT-PCR方法分别扩增不同减毒程度毒株的E基因,克隆、测序,继而对各毒株序列进 行比较.结果表明SA14-12-1-7强毒株与SA14-12-1-7-12-1-7株间只有3个氨基酸发生改变( E-107,E-176,E-439),SA14-12-1-7-12-1-7与SA14-12-1-7-9-7和SA14-12-1-7-5-3 株间有另3个氨基酸发生改变(E-138,E-279,E-315).SA14-12-1-7-9-7株与SA14-12-1-7-5-3株只有一个核苷酸NT -405不同,但未引起氨基酸改变.SA14-12-1-7疫苗株除保留SA14-12-1-7-12-1-7和SA14-12-1-7-9-7所改变的6个氨基酸外,另有2个氨基酸发生了改 变(E-177,E-264),共计在E区共发生8个氨基酸的替代.SA14-12-1-7-12-1-7株的 低神经毒力很不稳定而其余各株的弱毒特征很稳定.因此,E-176(Ile→Val),E-439(Lys→Arg)和 E-107(Leu→Phe)可能与神经外和神经内毒力减弱有关.E-138(Gul→Lys),E-315(Ala→Val)和 E-279(Lys→Met)的突变可能与神经毒力的减弱和稳定性相关.     

流行性乙型脑炎病毒减毒株和野毒株在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表现

乙型脑炎病毒减毒株(2-8株)和野毒株(SA14株)在生物学性质上有明显的不同,特别是嗜神经毒力方面,2-8株已丧失了对小白鼠、马,猴等敏感动物的脑内致病力。为了探讨这些生物学性质变化的物质基础,我们开展了乙脑强、弱毒株聚丙烯酰胺凝胶     

流行性乙型脑炎病毒的变异VII．乙型脑炎SA14-5-3株减毒活疫苗免疫后抗体持久性观察

1．1973—1978年内于某海岛小学儿童测得乙脑抗体阳性者,除1978年一例中和指数为1,862外,其余中和指数均<10,说明该岛乙脑隐性感染率较低,5年内为12.5％。 2．活疫苗初种后抗体阳性率为77．6％,一年后下降至57.7％,再接种一针后抗体即迅速上升至100％． 3. 活疫苗初种后次年再接种一针,其中和抗体水平维持较好,五年后其阳性率仍为70．6％。 4．活疫苗初种后,中和指数>1000的儿童其抗体可维持较久。<1000者一年后下降约60％,但再接种后中和指数述。>10c0者其抗体阳性率在第五年仍维持92.8％,<1000者则至第五年已降为58．8％。考虑到其中一部分儿童仍有隐性感染,因此活疫苗接种后五年的实际抗体阳性率可能还低些。     

流行性乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2E基因稳定性研究

为研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因稳定性,将乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHK)上传至18代,应用RT-PCR分别扩增PHK6代、PHK7代、PHK8代、PHK13代、PHK18代E蛋白基因并测序后,与Genebank中乙脑病毒减毒株SA14-14-2(D90195)进行比较分析。PHK6、PHK7、PHK8代病毒与D90195 E蛋白核苷酸和氨基酸序列完全相同。PHK13、PHK18代病毒与D90195E蛋白核苷酸序列同源性分别为99.8%、99.7%,与D90195E蛋白氨基酸序列同源性分别为99.6%、99.4%。各代次病毒E蛋白与减毒相关氨基酸未发生改变,同时所有突变的氨基酸均非SA14原有的,故不是恢复性突变。结果表明乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明乙脑病毒减毒株SA14-14-2及其生产的疫苗具有安全性。     

ELISA法检测乙型脑炎减毒活疫苗中卡那霉素和庆大霉素的残留量

用ELISA试剂盒检测乙脑减毒活疫苗中卡那霉素和庆大霉素的残留量。以间接竞争ELISA法检测线性范围内加入高、中、低3种浓度的卡那霉素和庆大霉素,测定其在疫苗稳定剂、疫苗稳定剂10倍稀释溶液、试剂盒稀释液中的回收率,以及在10倍稀释乙脑减毒活疫苗中的回收率。高、中、低浓度的卡那霉素在疫苗稳定剂、疫苗稳定剂10倍稀释溶液、试剂盒稀释液中的回收率为101.40%～124.80%之间;原倍疫苗稳定剂对庆大霉素的测定有明显干扰,在原倍疫苗稳定剂中低浓度和中浓度的庆大霉素的回收率高达2280%和575%,但其它测定条件下回收率在90%～125%之间。在10倍稀释的乙脑疫苗中加入一定量的卡那霉素和庆大霉素,回收率分别为124%和103.25%。用10倍稀释法测定1人份规格的乙脑减毒活疫苗17批、5人份规格的乙脑减毒活疫苗19批。乙脑减毒活疫苗10倍稀释后,可用ELISA试剂盒检测卡那霉素和庆大霉素残留量。