羧基末端亚单位肽疫苗KLH—Aβ24-42诱导正常BALB／c小鼠制备抗Aβ42抗体

目的：探讨亚单位肽疫苗KLH—Aβ24-42接种小鼠后特异性抗Aβ42抗体的产生情况。方法：将Aβ24-42羧基端与载体蛋白KLH结合制成亚单位肽疫苗免疫BALB／c小鼠。间接ELISA法检测其血清和脑匀浆上清液中的抗体滴度,HE染色对小鼠脑、肝、脾、心、肺和肾行形态学观察抗体毒性。结果：第2次接种后各实验组开始有血清抗体产生,抗体滴度随接种次数的增多而增高;但脑匀浆上清液中未检测到抗体;小鼠各主要脏器均未见病理性变化。结论：亚单位肽疫苗KLH—Aβ24-42免疫BALB／c小鼠后能产生抗Aβ42抗体,观察未见抗体对各重要脏器的毒性病理。     

羧基末端亚单位肽疫苗KLH-Aβ24-42诱导正常BALB/c小鼠制备抗Aβ42抗体

目的:探讨亚单位肽疫苗KLH-Aβ24-42接种小鼠后特异性抗Aβ42抗体的产生情况.方法:将Aβ24-42羧基端与载体蛋白KLH结合制成亚单位肤疫苗免疫BALB/c小鼠.间接ELISA法检测其血清和脑匀浆上清液中的抗体滴度,HE染色对小鼠脑、肝、脾、心、肺和肾行形态学观察抗体毒性.结果:第2次接种后各实验组开始有血清抗体产生,抗体滴度随接种次数的增多而增高;但脑匀浆上清液中未检测到抗体;小鼠各主要脏器均未见病理性变化.结论:亚单位肽疫苗KLH-Aβ24-42越免疫BALB/c小鼠后能产生抗Aβ42抗体,观察未见抗体对各重要脏器的毒性病理.     

纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究

霍乱毒素Ｂ亚单位（ＢＳ）已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体,但成本高,来源困难．用重组霍乱毒素Ｂ亚单位（ｒＢＳ）代替ＢＳ可克服上述缺点．ｒＢＳ用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性．用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２（ｐＭＭ－ＣＴＢ）培养物上清中制备得到了小批量ｒＢＳ纯品,在同等条件下与ＢＳ（Ｓｉｇ－ｍａ公司产品）进行理化、免疫学性质的对比研究,证实二者在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳带位置一致、分子量相同,纯度达９９％;在反相ＨＰＬＣ中出峰行为一致,纯度达１００％;在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同,等电点为７．９１．ｒＢＳＮ端起的２０个氨基酸序列为ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬ,与克隆基因来源株的毒素Ｂ亚单位同一段序列完全一致．氨基酸组成分析证实ｒＢＳ与ＢＳ相近．在免疫学性质分析中,ｒＢＳ与ＢＳ在免疫双扩散试验中与抗ＣＴ均出一条沉淀线且相互吻合;在免疫电泳试验中二者与抗ＣＴ在相应位置上产生一条沉淀弧;二者均能与神经节苷脂ＧＭ１结合且这种结合均可通过二者与抗ＣＴ的预保温处理而被阻断．对比研究结果揭示ｒＢＳ与ＢＳ性质完全一致,可代替ＢＳ用于     

CFA／1结构基因的核苷酸序列测定及其重组克隆的电镜观察

本文对编码cFA／1亚单位的核苷酸序列进行了测定。根据DNA序列推导,CFA／1的蛋白质序列由170个氨基酸组成,其中23个氨基酸为前导序列即信号肽。发现有3个位置上的氨基酸与由蛋白质测序的结果不同。第37位氨基酸是丙氯酸而不是缬氨酸,第76位的天冬酰胺由天冬氨酸所取代,第97位的氨基酸不是丙氨酸而是丝氨酸。cFA／1亚单位具有非常强的疏水性,47％的氨基酸为疏水氨基酸。cFA／l结构基因有典型的SD序列。CFA／1启动子有－10序列TACAAT,但没有发现 －35序列。CFA／1结构基因的G／c比例占4 0％左右。电镜观察结果证实,受体菌E．Coli C600本身没有菌毛,然而一旦转化进CFA／1重组质 粒,在其菌体表面则生长有浓密的菌毛。     

抗霍乱毒素B亚单位合成肽抗体的特性

<正> 有几个研究小组已报道霍乱毒素B亚单位合成肽能有效激发产生抗霍乱毒素的中和抗体。该合成肽有希望表现出霍乱毒素的生物功能,它对于研究霍乱毒素B亚单位的结构与功能(霍乱毒素结合GM_1-神精节苷脂和毒素进入细胞膜内分化)很有帮助。 我们根据霍乱毒素B亚单位结构制备出合成肽并检测了它的生物学活性。 1)根据Merrified的固相法我们合成了3个肽,CTB30-48,CTB41-50和CTB84-97(数字代表B亚单位N末端氨基酸残基的限定位置)。在合成中承蒙大阪大学Dr_1 Shimonish合作。 2)用肽-BSA(牛血清白蛋白)结合体免疫家免制备的抗肽血清与霍乱毒素呈     

HIV-1辅助蛋白Vpr多肽抗体的制备与鉴定

预测Vpr蛋白的B细胞抗原表位,并利用合成的B细胞表位肽制备Vpr特异性抗体。应用生物信息学技术获得Vpr蛋白共享氨基酸序列并预测其潜在B细胞抗原表位,与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)偶联合成多肽并免疫家兔,鉴定及纯化获得的多肽特异性抗体。软件预测显示,Vpr蛋白N端的第3～19位(N)和C端的第82～95位(C)氨基酸序列为潜在B细胞抗原表位;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价都达到1:105以上;Western-Blotting结果显示,无论对HIV-1B亚型还是CRF07_BC重组型的Vpr蛋白,其多肽N抗体和C抗体均能特异性识别;免疫沉淀结果显示,Vpr多肽N和C抗体也能特异性结合未变性的野生型Vpr或GFP-Vpr融合蛋白。利用生物信息学技术能成功预测Vpr蛋白B细胞抗原表位,免疫所获得的抗体具有较好的特异性和应用性。     

志贺毒素保护性抗原的基因克隆与序列分析

根据GenBank报道的志贺毒素A、B亚单位基因序列设计合成两对引物,以I型痢疾志贺茵的基因组为模板经PCR扩增获得3条DNA序列,将其分别插入pMD18—T载体,测序证明所获得的3条序列为志贺毒素A、B亚单位基因及其串联片段,与GenBank中相应序列比较,同源性分别为99．5％、100％和99．8％。通过计算机软件对所推测的氨基酸序列进行了蛋白质参数分析。志贺毒素保护性抗原基因的获得为志贺毒素的免疫学研究准备了必要的材料。     

恶性疟原虫子孢子CS抗原融合基因的表达及其生物活性

采用遗传工程技术获得了含有恶性疟原虫子孢子CS抗原融合基因的重组质粒pMC055－CS的工程菌株,能高效分泌CS抗原的融合蛋白至胞外,可达25mg／L．具有霍乱毒素B亚单位（CT－B）和子孢子CS的抗原性．将纯化的融合蛋白免疫C57纯系小鼠,免疫后抗CT－B抗体滴度可达1：3200～6400,抗CS抗体滴度可达1：320～640．免疫小鼠采用约氏疟子孢子腹腔攻击,保护率达34～45％．     

犬细小病毒VP2亲水性编码区的表达与免疫原性分析

目的：探讨犬细小病毒VP2亲水性编码区的免疫原性,为进一步研究基因工程亚单位疫苗奠定基础。方法：利用蛋白质分析软件Protean对已克隆的犬细小病毒VP2基因序列进行分析,选择亲水性好、抗原性强的293-520位氨基酸区域（命名为VP2S）作为靶序列,然后以已有VP2序列作为模版通过PCR扩增的方法获得VP2S,将VP2S克隆入pQE-31载体获得pQE-31-VP2S;将pQE-31-VP2S的原核表达产物经Western-blotting确认后免疫小鼠,用血凝抑制试验测定抗体水平。结果：293～520位氨基酸区域的亲水性好、抗原性强;重组质粒pQE-31-VP2S可成功表达大约29KDa的能被CPV抗血清识别的VP2S;VP2S能诱导小鼠产生高滴度的血凝抑制（HI）抗体（25）。结论：VP2S具有较强的免疫原性,能作为基因工程亚单位疫苗进行开发研究。     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素原融合基因的克隆、表达及重组蛋白特性分析

构建了霍乱毒素B亚单位 (CholeratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素原 (Proinsulin)的融合基因CTB -PROIN ,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET 30a(+)中 ,获得重组质粒pETCPI,并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中 ;重组菌株经IPTG诱导后 ,其表达产物经过 15 %SDS PAGE分析表明该菌株可以表达融合蛋白 ,其分子量约为 21.6kD ,且主要以包涵体形式存在 ,约占全菌蛋白的 25%。含CTB-PROIN重组蛋白的包涵体经过变性和复性后 ,CTB-PROIN可以在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果表明重组CTB PROIN蛋白可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别 ,说明该蛋白具有霍乱毒素和胰岛素的双重抗原性。同时在体外 ,CTB PROIN蛋白可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合 ,表明了该融合蛋白在体外具有生物活性。这些研究结果为利用原核生物表达系统研制廉价、高效的I型糖尿病口服疫苗奠定了基础。     

霍乱毒素B亚单位基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达

本工作成功地将霍乱毒素B亚单位(ctx B)基因插入到带有天门冬氨酸β-半醛脱氢酶基困(asd+)的pYAZ48质粒中,并将它转化至天门冬氨酸β-半醛脱氢酶突变(asd-)鼠伤寒沙门氏菌中。实验结果表明,ctx B亚单位基因能在鼠伤寒沙门氏菌中高效表达,并且表达的蛋白能分泌到细胞外。动物实验结果也表明：该疫苗菌株能在肠粘膜细胞定居;口服及全身免疫均能产生较高的抗体,并能增强动物细胞的免疫功能;对伤寒、霍乱有毒株的攻击有良好的保护效果。该系统的应用为疫苗基因工程提供了一个新的途径。     

表达轮状病毒SA11株Vp4的抗原表位诱导病毒中和抗体生成

以昆虫病毒Flockhousevirus（FHV）外壳蛋白为载体的外源抗原表位表达系统（FHV-RNA2载体系统）．在重组杆状病毒和重组pET系统中构建和表达了SA11Vp4胰酶切割位点两侧和重叠切割位点3个抗原表位氨基酸序列（抗原表位A,aa223~242;抗原表位B,aa243～262;抗原表位C,aa234～251）,并对其免疫原性进行了研究。结果表明：这3个抗原表位能诱导动物产生抗同源氨基酸序列的抗体和抗同源病毒（SA11）感染性的血清中和抗体。研究结果提示：RVVp4胰酶切割位点区氨基酸序列除了具有胰酶切割增强病毒感染力外,还具有诱导动物机体产生血清中和抗体的能力,是RV重组抗原表位亚单位疫苗研究中重要的抗原表位氨基酸序列。     

HIV-1复合多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒疫苗的构建及小鼠免疫原性

将HIV-1 p24基因插入至人工设计的复合多表位基因MEG中, 获得嵌合基因MEGp24; 将MEGp24插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游, 构建出鸡痘病毒重组转移质粒; 经转染和BrdU加压筛选, 以基因组PCR和Western blot法筛选出重组病毒; 将重组病毒大量制备并纯化后, 分别于0, 14, 42天肌肉注射免疫BALB/c小鼠; 第3次免疫后一周, 采集小鼠全血与脾脏, 分离血清并无菌制备脾淋巴细胞, ELISA法检测小鼠血清HIV-1抗体、脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-α和IL-2的含量, 流式细胞仪测定CD4⁺, CD8⁺ T淋巴细胞亚类数量, 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性. 结果表明, 重组病毒刺激小鼠产生HIV-1特异性抗体, 出现T细胞亚类数量增加, 产生针对HIV-1 H-2^d限制性CTL表位的特异性靶细胞杀伤作用, 同时免疫小鼠脾细胞在HIV-1抗原肽的刺激下分泌Th1类细胞因子的水平大幅增加. 研究提示多表位嵌合基因重组FPV疫苗具有良好的免疫原性, 可诱导小鼠产生HIV-1特异性细胞和体液免疫应答.     

F1-V重组亚单位疫苗对鼠疫耶尔森氏菌141强毒株皮下攻毒保护性的研究

在此实验中, 设计了一种包含2种成分的重组融合蛋白作为疫苗成分来防护鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia)可能产生的生物威胁. 重组F1-V蛋白与铝佐剂结合, 分别以10, 20, 50 mg剂量免疫BALB/C小鼠, 周期为2个月. 检测小鼠血清抗体水平和T辅助细胞的亚型. 免疫后小鼠以25~600 LD₅₀剂量的鼠疫耶尔森氏菌141强毒株进行皮下攻毒实验. 结果证明, F1-V重组蛋白在 小鼠体内诱导产生足够保护的免疫应答. 血清IgG水平是产生最终保护力的一个重要因素. 20 μg的免疫剂量可以诱导血清抗体效价高达51200, 使小鼠对400 LD50的鼠疫耶尔森氏菌产生100%的保护. F1-V重组蛋白引发的抗体亚型主要为IgG1类, 说明抗体反应趋向Th2型反应. 流式细胞分析表明, 铝佐剂主要帮助F1-V重组融合蛋白诱导强烈的体液免疫而不是CTL细胞免疫应答.表明F1-V重组亚单位疫苗株有希望成为一种新型的鼠疫疫苗候选株.     

霍乱cT-B和LPs-o双价抗原工程菌苗株的构建

作者将霍乱弧菌O抗原及毒紊B亚单位基因片段,经DNA体外重组技术,得到了能表达双价抗原的工程菌株1046(pMG305)。经GMl一ELlsA分析表明该菌株能够表达特异的霍乱cT—B抗原,且能分泌到胞外,通过菌体凝集,全细胞O抗原酶联分析和血凝抑制试验表明在1046(pMG305)菌体表面表达了霍乱的0抗原,它的脂多糖O抗原通过sDS-PAGE电泳分析．显示它表达了霍乱LPs的特征区带。小鼠腹腔免疫后用霍乱弧菌毒株攻击表明．有良好的保护作用．因此1046(pMG30s)可望成为霍乱活疫苗的候选株。     

合成肽疫苗应用的现状

<正> 近年来一些研究表明合成肽有可能做疫苗。虽然至今还未考虑临床试用,但最近证实口服合成免疫原的志愿者可产生抗大肠杆菌肠毒素的中和抗体。 理想的合成肽疫苗必须能模拟在诱导有效保护性抗体反应中起重要作用的,连续或不连续(或两种类型)的抗原决定簇;应含有能起佐剂作用的序列;对特殊疾病有特异性,且不产生与宿主正常组织起交叉反应的     

阿尔茨海默病重组4Aβ15-TF亚单位疫苗的免疫原性研究

目的:研究重组嵌合抗原4Aβ15-TF的免疫原性,评估其作为亚单位疫苗的可行性。方法:设计合成了重组融合蛋白4Aβ15-TF的基因序列,插入原核表达载体p TIG-Trx中,用大肠杆菌表达并纯化重组嵌合抗原4Aβ15-TF,与铝佐剂配制成亚单位疫苗免疫C57BL/6小鼠以研究其免疫原性。结果:重组嵌合抗原4Aβ15-TF免疫小鼠后刺激其产生了抗β淀粉样蛋白(Aβ)42的特异性抗体,抗体滴度4次免疫后达到较高水平,抗体亚型主要为IgG1型,并且伴随着少量的IgG2b,T淋巴细胞增殖实验证明免疫后产生了针对辅助性T细胞表位的T细胞免疫反应,不产生针对Aβ42的T细胞免疫反应。结论:大肠杆菌表达的重组嵌合抗原4Aβ15-TF具有良好的免疫原性,能够刺激产生高滴度的抗Aβ42抗体,并且产生的免疫反应主要为Th2型,无Aβ42特异的T淋巴细胞增殖反应。提示它可作为候选疫苗用于预防或免疫治疗阿尔茨海默病。     

前列腺素抑制剂消炎痛抑制糖尿病痛过敏大鼠隐神经中Aδ和C单位的传入活动

实验观察了前列腺素（prostaglandins,PGs)合成限速酶－非选择性环氧合酶（cyclo-oxygenase,COX)抑制剂消炎痛和外源性前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2)对糖尿病痛过敏大鼠隐神经中Aδ单位和C单位传入活动的影响,结果发现,糖尿病痛过敏大鼠Aδ单位和C单位的传导速度和它们的机械阈值显著降低,少数Aδ单位（4／24）和C单位（2／18）具有自发活动,腹腔注射消炎痛后能明显缓解糖尿病痛过敏大鼠的机械性痛过敏,并抑制自发放电,在消炎痛阻断内源性PGs合成后,外源性PGE2能使糖尿病痛过敏组和对照组大鼠Aδ单位和C单位的机械阈值显著降低,并诱发糖尿病痛过敏组大鼠3个Aδ单位（3／24）和1个C单位（1／18）,以及对照组大鼠2胪Aδ单位（2／13）产生传入活动,结果提示,在患糖尿病性神经病时,PG的合成和释放增多,这些PGs敏化或和激活Aδ单位和C单位,诱发糖尿病大鼠产生痛过敏和触诱发痛。     

丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究

丙型肝炎病毒(HCV)基因易发生变异, 尤其是含中和抗原表位的高变区1(HVR1)变异性最大. 模拟HVR1的B细胞表位具有涵盖多种天然表位的抗原特性, 保守的T细胞表位具有各型间的相对保守性. 为解决HCV高变性造成的疫苗研究障碍, 我们选取HCV E2区HVR1(384～410 aa)模拟B细胞表位9条、C区的保守CTL表位2条(35～44 aa, 132～140 aa)、NS3区保守的CTL表位1条(1073～1081 aa)及NS3区保守的Th表位1条(aa 1251～1259), 各表位之间以插入3个氨基酸为连接臂, 人工合成上述13条表位基因串联的HCV多表位抗原基因(mfc). 将mfc与gst基因融合, 表达了多表位抗原蛋白GST-MFC. 同时, 构建了白介素-2信号肽基因、PADRE表位基因和mfc基因串联的候选HCV DNA疫苗, 即质粒pVAX1.0-st-mfc. 以GST-MFC蛋白免疫家兔和质粒pVAX1.0-st-mfc免疫小鼠, 采用ELISA和Western blot方法, 应用10条具有代表性的HCV HVR1合成肽进行检测, 证明有9条HVR1合成肽能与所有免疫动物血清反应, 交叉反应率(cross reactivity, CR)为90%. 应用HCV抗体阳性的感染者血清与多表位抗原GST-MFC蛋白进行反应, 证明其反应识别率(reactivity frequency, RF)为75%. 上述结果表明, 筛选合成的HCV多表位抗原基因mfc具有HCV中和抗原表位的特征, 可作为HCV疫苗研制的候选基因.     

霍乱毒素B亚单位基因分泌型表达载体的构建及转化烟草的研究

为了探索利用植物分泌特性来表达重组蛋白的可行性,先构建了含钙网蛋白信号肽的植物双元载体pBIcal,再向该载体中插入霍乱毒素B亚单位编码基因,最后得到表达载体pBIcal—ctb。通过根癌农杆菌介导,该表达载体转化烟草,在卡那霉素抗性培养基上筛选,得到30棵抗性植株。经PCR鉴定,霍乱毒素B亚单位基因已经整合到烟草基因组中。初步表达分析表明,转基因烟草中含有具生物活性的霍乱毒素B亚单位蛋白。