尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2Ⅱ的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒酸性磷酯酶 A2 ( A.a APLA2 )基因克隆至温敏表达载体 p BLMVL2 ,在大肠杆菌 RR1中成功诱导表达 .表达产物 A.a APLA2 约占细菌蛋白质总量 2 5 % ,并以包涵体形式存在 .纯化包涵体后 ,将产物变性、复性 ,然后用 FPLC Superose TM1 2纯化 ,产物经过 SDS- PAGE检测只有单一条带 .对纯化后的表达 A.a APLA2 进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定 .结果显示 ,A.a APLA2 的酶活性处于变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶 A2 和碱性磷脂酶A2 的酶活性之间 ,没有抑制血小板聚集活性 ,只有微弱溶血活性 .最后对 PLA2 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A2泊表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２Ｉ（Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ）的基因克隆至表达载体ｐＢＬＭＶＬ２,在大肠杆菌ＲＲ１中成功表达,表达产物Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ约占细菌蛋白质总量的３０％,以包含体的形式存在。纯化包含体后,将产物变性,复性,然后用ＦＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＾ＴＭ１２纯化,产物经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测只有单一条带。     

尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2 (A .aBPLA2 )基因克隆至温敏表达载体 pBLMVL2 ,在大肠杆菌RR1中成功诱导表达 .表达产物A .aBPLA2 约占细菌蛋白质总量的 2 0 % ,并以包涵体的形式存在 .纯化包涵体后 ,将产物变性、复性 ,然后用FPLCSuperoseTM12纯化 ,产物经过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只有单一条带 .对纯化后的表达A .aBPLA2 进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定 .结果显示 ,表达A .aBPLA2的酶活性与变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶A2 酶活性相近 ,具有类似变性后复性江浙蝮蛇碱性磷脂酶A2 的溶血活性 ,没有抑制血小板聚集活性 .最后对磷脂酶A2 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A₂（A.aBPLA₂）基因克隆至温敏表达载体pBLMVL2,在大肠杆菌RR1中成功诱导表达.表达产物A.aBPLA₂约占细菌蛋白质总量的20％,并以包涵体的形式存在.纯化包涵体后,将产物变性、复性,然后用FPLC Superose^TM12纯化,产物经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只有单一条带.对纯化后的表达A.aBPLA₂进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定.结果显示,表达A.aBPLA₂的酶活性与变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶A₂酶活性相近,具有类似变性后复性江浙蝮蛇碱性磷脂酶A₂的溶血活性,没有抑制血小板聚集活性.最后对磷脂酶A₂的结构与这些活性的关系进行了讨论.     

尖吻蝮蛇酸性磷脂酶A2的纯化和初步晶体学

为进一步揭示影响血小板聚集活性的结构基础,纯化了江西尖吻蝮蛇（Ａｇｋｉｓｔｒａｄｕｎ ａｃｕｔｕｓ）酸性磷脂酶Ａ２。江西省吻蝮蛇蛇毒经ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换柱层析,两步ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换柱层析以及Ｍｏｎｏ）ＧＦＰＬ离子交换柱层析,得到了ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳和等和集电泳均一的磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）,其分子量为１６．５ＫＤ,等电点为４．３,经测定,该酶具有抑制ＡＤＰ诱地     

蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2的空间晶体生长

对血小板聚集抑制剂—蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2结晶研究的基础上,进行了空间结晶买验,与地面对照实验结果比较,空间的微重力环境对该酶的晶体生长有明显的改进作用.     

尖吻蝮蛇毒磷脂酶A2基因的克隆与序列分析

从尖吻蝮蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,经ＲＴＰＣＲ扩增磷脂酶Ａ２的基因,以江浙蝮蛇的酸性磷脂酶Ａ２基因为探针杂交筛选克隆,分离得到４种磷脂酶Ａ２基因。经双向测序测定了这些磷脂酶Ａ２同功酶基因的全序列,并由此推导出编码的氨基酸序列。运用计算机软件推算了它们的等电点,按照等电点和结构特征将它们分别命名为尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２Ｉ（Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ）、尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２ＩＩ（Ａ．ａＡＰＬＡ２ＩＩ）、尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶Ａ２（Ａ．ａＢＰＬＡ２）和尖吻蝮蛇毒Ｌｙｓ４９磷脂酶Ａ２（Ａ．ａＬｙｓ４９ＰＬＡ２）。其中Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ的１～１０位氨基酸残基序列同以前分离得到的尖吻蝮蛇酸性磷脂酶Ａ２已测定的１～１０位氨基酸残基序列完全一致。Ａ．ａＬｙｓ４９ＰＬＡ２基因则由于其推导出的４９位氨基酸残基由Ｌｙｓ代替了Ａｓｐ而区别于以前克隆到的磷脂酶Ａ２基因。最后运用计算机软件比较了它们的同源性。这一组磷脂酶Ａ２基因的克隆,将为进一步研究磷脂酶Ａ２的结构与功能的关系提供更多的信息。     

江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶A2基因的表达

将江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２基因克隆至表达载体ｐＢＬＭＶＬ２,转化入大肠杆菌ＲＲ１,经过温敏诱导,ＳＤＳ－Ｐ;ＡＱＧＥ检测,在约１４ｋＤ处有一表达条带。表达产物酸性磷脂酶Ａ２约占细菌蛋白总量的３０％,并以包涵体的形式存在。纯化包涵体后,将产物变性,复性,然后用ＦＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ＾ＴＭ１２纯化,产物经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测只有单一条带。     

蝮蛇毒碱性磷脂酶A_2基因的克隆

从蝮蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ．利用人工合成寡核苷酸引物作逆转录,以ｃＤＮＡ为模板进行体外扩增,获得磷脂酶Ａ２（简称ＰＬＡ２）基因,克隆至ｐＢＳ－ｋｓ载体中。通过对３个碱性ＰＬＡ２（简称ＢＰＬＡ２）基因单独克隆分别作ＤＮＡ全序列分析,推导ｐｒｏ－ＢＰＬＡ２由１３８个氨基酸残基构成,与已测定的部分氨基酸序列比较,基本相符。该基因成功的克隆,不仅推导出ＢＰＬＡ２的蛋白质全序列,也为进一步开展蛇毒功能肽蛋白质工程的研究工作打下了良好的基础。     

钙离子对江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2结构与功能的影响

钙离子在江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ_２中的作用是多方面的。它不仅能够引起酸性磷脂酶Ａ_２在溶液中构象的变化,而且对该酶活性有较大的影响。Ｃａ~（２＋）为酶活力所必需,当Ｃａ~（２＋）浓度达到０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ时,酶表现出很高的活力;Ｃａ~（２＋）浓度超过０．５ｍｍｏｌ／Ｌ时,催化反应出现一个明显的延滞期。化学修饰表明Ｈｉｓ_（４７）在表现活力方面起重要作用,Ｃａ~（２＋）的存在可降低其修饰反应的速度,提示这是由于Ｃａ~（２＋）引起构象发生变化而造成的。     

五步蛇蛇毒磷脂酶A_2的纯化及部分性质

经Sephadex G-75和QAE-Sephadex A-50离子交换层析等方法,从湖南产五步蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中纯化一种均一的酸性磷脂酶A_2。SDS-PAGE测得分子量为15.8kD,按氨基酸残基计算其分子量为14.352kD,IEF-PAGE测得等电点为5.32。氨基酸组份分析表明磷脂酶A_2分子由128个氨基酸残基组成,富含Asp和Glu,不含中性糖。PLA_2酶活性的最适温度为45℃,最适pH为8.5左右,没有抗胰蛋白酶的活性,具一定的热稳定性。K~+、Ca~(++)和Na~+离子激活,而Cd~(++)、Sn~(++)、Cu~(++)、Li~+、Hg(++)、Zn~(++)、Fe~(++)和Co~(++)离子可抑制或完全丧失酶活力。手工微量顺序分析测得PLA_2分子N-末端氨基酸为Leu。此酶对小白鼠的LD_(50)至少大于10mg/kg(ip)。     

尖吻蝮血液11项生化指标的测定

对尖吻蝮Agkistrodon acutus血液11项牛化指标进行了测定,并对其测定结果进行了t检验.结果显示,尖吻蝮血液生化指标中葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、血清钠(Na)、血清氯(C;)、m清钙(Ca)、血清磷(P)、血清镁(Mg)的生化指标在雌雄之间差异不显著(P>0.05);总蛋白(IP)为雌、雄之间差异显著(P<0.05);总胆固醇(CHO)、白蛋白(ALB)、血清钾(K)在雌、雄之间差异极显著(P<0.01).从测定结果可看出尖吻蝮雌雄间血液生化值筹异不大.     

蕲蛇蛇毒中一种新型金属蛋白酶AA-MP-I的纯化和表征

本研究通过嗜硫色谱、Sephadex G-75、蓝胶和POROS HQ20离子交换色谱,从蕲蛇蛇毒中分离得到一种新组分AA-MP-I。该酶为分子量22.9kDa的单体蛋白,等电点为5.55,不含中性糖基,N端序列为STE-FQRYMEIVIVVDHSMVK,结果表明其为新型P-I型金属蛋白酶,对温度敏感,具有抗凝血活性,40℃下抗凝血活性最强,具有出血毒性,无磷脂酶A2活性。     

尖吻蝮蛇毒中精氨酸脂酶的分离纯化与性质研究

目的：从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出精氨酸脂酶并进行性质研究。方法：利用亲和层析、DEAE—Sepharose FF、Superdex 75柱对尖吻蝮蛇毒进行分离纯化。结果：分离纯化出的2个精氨酸脂酶活性组份分子量分别为36000、30000,它们的HPLC纯度也都达到97％以上。结论：为其临床应用打下了基础。     

五步蛇毒血小板聚集抑制因子cDNA的克隆及表达

采用一步法抽提五步蛇毒腺总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ的扩增出低分子量金属蛋白酶酶原的ｃＤＮＡ,克隆并测定了全序列。根据推导的氨基酸序列,发现其中一个ｃＤＮＡ除编码一个低分子量金属蛋白酶外,羧基端还包括一个血小板聚集抑制因子,这一结果证实了蛇毒金属蛋白酶和血小板聚集抑制因子起源于蛇毒金属蛋白酶酶原的前体。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)人工室外孵化试验

目的　研究在自然环境条件下人工孵化尖吻蝮蛇卵的孵化成活率。　方法　试验于 2 0 0 1年 6～9月在湖南永州之野异蛇实业有限公司试验蛇场内进行。试验基地室内外结合室内面积为 4 m× 3 m,建成多层立体式蛇窝。室外面积为 1 5 m× 1 0 m,灌木和杂草覆盖度 90 %以上 ,有 1个 3 m× 2 m的饮水池 ,供蛇饮水。种蛇 1 5条。孵化湿度 75 %～ 85 % ,温度比场外自然环境温度略低 2～ 3℃。　结果　尖吻蝮蛇平均产卵数为 1 4 .3枚 ;平均孵化天数为 2 2 .5天 ,孵化率为 95 %以上。　结论　在自然环境条件下可以人工孵化尖吻蝮蛇卵 ,而且受精良好的雌尖吻蝮蛇卵出壳率高     

尖吻蝮蛇毒内一种新抗凝血因子ACF II 的纯化及特性

利用阴离子交换层析、凝胶过滤及阳离子交换层析三步方法, 从皖南尖吻蝮蛇毒中分离纯化到一个新的抗凝血因子ＡＣＦＩＩ（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒＩＩ） 。纯化的ＡＣＦＩＩ在ＰＡＧＥ、ＳＤＳＰＡＧＥ和ＩＥＦＰＡＧＥ图谱上均呈单一区带。ＡＣＦＩＩ由两条分子量为１４．６ ｋＤ 的肽链通过二硫键连接在一起, 其等电点为７．０。ＡＣＦＩＩ具有显著的抗凝血活性, 在体外延长ＰＰＴ 时间的最终浓度为０ ．４ ｍｇ／Ｌ。ＡＣＦＩＩ不具有类凝血酶活性、磷脂酶Ａ２ 活性和纤溶活性,也没有出血活性和毒性, 是一种潜在的高效抗凝药物。     

蕲蛇酶抗栓作用机理的初步分析

动物实验结果示,蕲蛇酶能裂解纤维蛋白原成为可溶性纤维蛋白,降低血中纤维蛋白原浓度,抑制血小板聚集,对抗在酶诱导的血浆凝块订的血浆凝块回缩,因而发挥防血栓形成作用。对纤维蛋白平板试验无直接溶纤作用,但能增加实验动物血中ｔ－ＰＡ活性。可能通过促使血管内皮细胞释放ｔ－ＰＡ而发挥溶栓作用。