一种简单快速植物组织冰冻切片方法

比较不同冷冻方法对植物细胞超微结构的影响,结果表明:直接包埋法处理的植物细胞超微结构保存较好,而液氮冷冻处理的植物细胞内膜系统损伤严重.建立了一种直接包埋冷冻和适当回温相结合的方法,不仅可以制作出植物细胞基本结构保存完整的组织切片,而且避免了使用冰冻保护剂的弊端.其操作程序是:样品固定→冰冻与包埋→适当回温→快速切片→展片→染色.此法制作的切片可进行不同的染色和组织细胞化学测定,具有操作简便,易于推广的特点.     

冷冻电子断层成像技术及其在生物研究领域的应用

冷冻电子断层成像可以在纳米级尺度上研究那些结构不具有均一性的分子、病毒、细胞器以及它们之间组成的复合体的三维结构。在过去的十年中,电子显微镜硬件、冷冻制样设备和技术,以及自动化断层数据收集方法的进步使得本研究领域得到快速发展。本文对冷冻电子断层成像的方法,包括基本原理、样品制备、断层数据采集和图像处理、三维重构以及重建信息的理解和展示、近年来在生物样品领域的一些典型应用以及前景作一简单介绍。     

组织微阵列的原理及应用

组织微阵列是将若干石蜡包埋块上的各种典型组织或细胞转移到一个新石蜡块上重新构建微型化高通量组织阵列的方法,可以有效地进行各类临床病理组织的原位观察和研究。组织微阵列技术可以在一块薄片上同时排列几百个样品,进行高通量的基因和蛋白质分析,且能够充分利用组织资源,将多个样品的平行实验一次完成。在分析RNA和某些蛋白质时,石蜡包埋组织的使用受到限制。为了解决这个问题,发展了冷冻微阵列的方法。该方法快速便捷,效率很高,为使用临床标本及其相关的病理数据库来进行基因和蛋白质水平的研究提供了机会。该阐述了来自于组织和细胞系的微阵列的制备方法和技术特点,并概述它们在临床研究中的应用以及发展前景。     

不同保存方法对川金丝猴粪便DNA提取效果的影响

目的:川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)是我国特有珍稀物种,其粪便作为一种非损伤性样品,为珍稀濒危动物的种群数量调查、遗传多样性评价、亲缘关系、系统进化等研究带来了很大便利,本研究试图建立高效、简便的粪便样品保存方法。方法:在现有珍稀濒危动物粪便样品保存方法的基础上,分别使用干燥法、冷冻法和干燥-冷冻法保存川金丝猴的粪便样品,比较了不同保存方法的DNA提取效果,以及对mtDNA控制区片段的PCR扩增成功率和微卫星基因的PCR扩增效率。结果:干燥法、冷冻法和干燥-冷冻法三种不同保存方法保存粪便1周时间后,提取的粪便DNA样本扩增mtDNA片段的成功率均为92%,微卫星基因的扩增成功率分别为79%、78%、80%;保存2个月后,mtDNA片段扩增成功率分别为80%、76%和80%,微卫星基因扩增成功率分别为65%、61%、67%;保存6个月后,mtDNA片段扩增成功率分别为56%、52%和64%,微卫星基因扩增成功率分别40%、34%、46%。因此,随着保存时间的增长,三种方法的保存效率都将明显降低,但干燥-冷冻法得到的DNA样本扩增成功率相对较高。结论:粪便样品能够为川金丝猴的遗传多样性评价等相关研究提供有效信息,干燥-冷冻法保存能够更为有效的保证DNA的提取和基因扩增效率。     

首次由用玻璃化保存法冷冻保存的猪受精卵产出仔猪

日本爱知县农业综合研究所2月6日宣布,由用玻璃化保存法(超速冷法)冷冻的猪受精卵产出仔猪获得成功。牛和小鼠由使用玻璃化保存法的冷冻受精卵产仔获得成功。猪的成功在世界上还是首例。这次爱知县农试的方针是使用了杂种猪受精卵,但今后打算使用纯系猪受精卵进行系统培育。 猪受精卵脂肪滴多。所以一旦冷冻,细胞容易破坏,从冷冻受精卵获得产仔很难。爱知县农试用高浓度乙二醇作冷冻保护剂冷冻受精卵,融解后在3阶段释稀释乙二醇。据说受精卵融解后经48小时培养,受精     

浅谈超速离心技术在生物学中的应用

超速离心机是一种利用高速旋转的转头所产生的强大离心力场,对样品进行分离、提纯、分析的精密仪器。从1926年瑞典物理学家Sydberg研制成功第一台超速离心机以来,至今已有五十多年的历史。超速离心机已有小规模的试制到成批地进行商品生产。由于超速离心机的产生和超速离心技术的发展以及电子显微镜的作用,人们对细胞的结构和功能的了解越来越清楚了。过去人们只能在电子显微镜中看     

杀螟杆菌噬菌体快速测定试验

杀螟杆菌工业生产中经常碰到噬菌体的危害,而目前一般沿用的噬菌体检查方法要经过8小时才看出结果。因此,找出一种快速而准确的检查方法是非常必要的。尽早尽快地确定茄瓶种子、种子罐菌液中是否污染了噬菌体;是保障发酵罐正常生产的有效措施。     

超速离心机制备冷冻干燥保存菌种

利用超速离心机原有的冷冻系统和真空系统进行冷冻干燥的方法冻干保存了３０种国际标准菌种,４℃保存一年后,随机检测了其中的１８种,全部存活良好。用本法还可以制备出１、２、３、１０ｍｌ不同容量的冷冻干燥生物制剂,适用于中批量各种冻干生物制剂的生产和研究。一机两用,省资金,省用房,提高了机器的利用率。     

冷冻聚焦离子束-扫描电镜成像技术研究进展

冷冻聚焦离子束-扫描电镜成像(Cryo-FIB-SEM)是一种新兴的成像检测技术,在原位进行冷冻聚焦离子束切割和冷冻扫描电镜成像,为研究天然含水状态下生物样品内部未被破坏的原始结构打开了一扇窗口。近年来,该技术在生命科学领域的应用研究取得了一系列重要进展。该文对其在冷冻体积连续成像、冷冻光电关联成像、冷冻透射扫描成像、冷冻含水切片制备监控及冷冻扫描图像处理等方面的研究进展进行综述,并展望了该技术在大体积生物样品三维原位成像研究领域的前沿性发展趋势,以期推动Cryo-FIB-SEM技术在生物样品三维结构研究中的应用。     

薄层色谱法

薄层色谱法是近20年来迅速发展起来的一种微量而快速的色谱方法。它是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃或塑料板上成一薄层,把要分析的样品滴加到薄层上,然后用适当的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。由于这种方法具有快速、微量、灵敏度高、操作简便、仪器设备简单等许多优点,现在已成为一种应用范围日趋广泛的重要分析方法。     

双抗体夹心ELISA与NIH法在狂犬病疫苗抗原检测中的比较

通过用单克隆抗体制备双抗体夹心ELISA,快速检测狂犬病疫苗中狂犬病毒糖蛋白(G)的含量,将狂犬病疫苗的检定时间由28天缩短至2个工作日,以此缩短疫苗库存待检时间,提高疫苗的生产和销售效率,并最终替代NIH动物法.将待检的狂犬病疫苗样品在同一性别12～14g昆明鼠体内作效力检定试验(NIH),同时用双抗体夹心ELISA检测狂犬病疫苗中狂犬病毒G蛋白含量,用Microsoft Office Excel做出标准品和各样品疫苗的线性关系图并计算出疫苗效力值E-NIH.结果用双抗体夹心ELISA所得的E-NIH与对应的小鼠效力试验所得结果M-NIH之间呈正相关性;同一批狂犬病疫苗分次测得E-NIH值在2.41～5.85之间,而相应的M-NIH值在5.11～10.19之间.从而得出E-NIH与相应的M-NIH之间存在明显的线性关系;与NIH法比较,ELISA具有重复性好、成本低、快速等优点;用双抗体夹心ELISA替代小鼠效力试验是可能并可行的.     

果蔬产品中甲型肝炎病毒风险评估和基因分型研究

本研究探讨了果蔬产品中甲肝病毒风险评估和基因分型;采用实时荧光RT-PCR对216个果蔬样品进行了检测,检测出6个阳性样品,分别为冷冻草莓、冷冻蓝莓、冷冻土豆丁、冷冻苹果丁和冷冻树莓样品,占总样品数的2.8%;采用巢式RT-PCR对6个阳性样品进行基因扩增,样品冷冻苹果丁(210-1999)和冷冻蓝莓(210-2002)获得单一条带,经系统进化和同源性分析,二者皆属于甲肝病毒ⅠB亚型;本研究为果蔬产品企业和食品安全管理部门提供了此类产品甲肝病毒污染的风险信息,奠定病毒基因溯源基础,为企业从种植、收获、加工、包装等各关键控制点保证产品安全提供技术支撑,为流行病学诊断提供可靠数据。     

不同扫描电镜制样方法观察棉花叶片气孔

扫描电子显微镜是研究棉花气孔发育及形态建成的重要手段。为了分析常规扫描电子显微镜、环境扫描电子显微镜、冷冻扫描电子显微镜、涂撕法扫描电子显微镜4种方法在棉花气孔观察应用上的优劣,本文通过对棉花叶片取材、制样、镜检,横向对比了这4种方法的取样方式、制样时间和镜检结果。结果表明:常规扫描电子显微镜生物制样时间最长,样品有一定的失水,图片衬度效果最好;环境扫描电子显微镜制样时间最短,样品失水严重,图片衬度较差,样品形态与常规扫描电子显微镜生物制样方法所观察到的形态一致;冷冻扫描电子显微镜制样时间较长,样品未发现失水,图片衬度较差;涂撕法扫描电子显微镜制样时间较短,样品未发现失水,图片衬度较好,但相对于冷冻扫描电子显微镜制样方法而言,其样品呈现出反向的形态,同时由于尖端放电,荷电较多。本研究分析了不同的扫描电子显微镜制样方法适合得到怎样的棉花气孔图片数据,为棉花抗旱相关的基础和应用研究提供了一定的参考。     

小鼠冷冻胚胎和精子SNP遗传鉴定方法的建立

目的建立小鼠冷冻胚胎和精子SNP(single nucleotide polymorphism)分型方法,用于冷冻胚胎和精子快速遗传鉴定方案。方法以中科院上海实验动物中心(国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心)提供的小鼠冷冻胚胎和精子为样本,采用全基因组扩增技术和PCR-LDR分型技术建立小鼠冷冻物SNP遗传鉴定方法。结果全基因组扩增技术能大幅度增加冷冻胚胎样本的DNA总量;PCR-LDR分型方法适用于小鼠全基因组45个SNPs的分型;分型确定C57BL/6,BALB/c,FVB/NJ等胚胎和精子各10种近交系,SNP位点信息与测序结果一致;小鼠冷冻胚胎个数与SNPs检出个数成正比,当胚胎数达到12以上时SNP检出率100%。结论实现近交系小鼠冷冻胚胎和精子快速SNP基因分型及遗传质量鉴定。     

一种高效的灵芝菌丝体总蛋白的提取方法

灵芝基因组精细图谱的完成必将推动灵芝蛋白质组学的快速发展,因此,建立一种高效稳定的灵芝菌丝体总蛋白的提取方法是蛋白质组学研究的首要步骤。本文以灵芝菌丝为研究对象,使用超声波、液氮冷冻研磨和超声波联合液氮冷冻研磨等三种破碎细胞壁的方法,采用含不同蛋白酶抑制剂的尿素-硫脲法溶解菌丝体总蛋白,经SDS-PAGE电泳分析和蛋白浓度测定,发现液氮冷冻研磨结合尿素-硫脲溶解蛋白质的方法适合灵芝菌丝体总蛋白的提取,从每克新鲜菌丝中能提取16 g蛋白质,且蛋白质种类多,条带丰度高。     

双抗体夹心ELISA与NIH法在狂犬病疫苗抗原检测中的比较

通过用单克隆抗体制备双抗体夹心ELISA,快速检测狂犬病疫苗中狂犬病毒糖蛋白(G)的含量,将狂犬病疫 苗的检定时间由28天缩短至2个工作日,以此缩短疫苗库存待检时间,提高疫苗的生产和销售效率,并最终替代 NIH动物法。将待检的狂犬病疫苗样品在同一性别12～14g昆明鼠体内作效力检定试验(NIH),同时用双抗体夹 心ELISA检测狂犬病疫苗中狂犬病毒G蛋白含量,用Microsoft Office Excel做出标准品和各样品疫苗的线性关 系图并计算出疫苗效力值E-NIH。结果用双抗体夹心ELISA所得的E-NIH与对应的小鼠效力试验所得结果M- NIH之间呈正相关性;同一批狂犬病疫苗分次测得E-NIH值在2．41～5．85之间,而相应的M-NIH值在5．11～ 10．19之间。从而得出E-NIH与相应的M-NIH之间存在明显的线性关系;与NIH法比较,ELISA具有重复性好、 成本低、快速等优点;用双抗体夹心ELISA替代小鼠效力试验是可能并可行的。     

真菌的冷冻扫描电镜观察

冷冻扫描电镜法是根据低温生物学原理,生物样品经过超低温处理后进行电镜观察的一种方法。经超低温冷冻固定的生物样品可保持其原有的形态特征和生物活性。样品内部水份在超低温(—150℃)下,即使在真空中升华速度     

五种豆科药用植物种子超低温保存技术研究

以豆科药用植物降香檀、决明、含羞草、灰毛豆和猪屎豆的成熟种子为材料,探讨含水量对其发芽率的影响,以及超低温冷冻方式对种子超低温保存的影响。结果表明,降香檀、决明、猪屎豆和灰毛豆种子发芽率均随含水量的下降而从80%左右降至20%以下,而含羞草种子含水量低于10%时,其发芽率仍在75%以上。经超低温冷冻后,五种豆科药用植物种子发芽率较对照组均有显著差异;适宜的含水量下,种子经过超低温冷冻后其发芽率与对照组差异不显著,甚至高于对照组。三种冷冻方法中,玻璃化冷冻法更适合降香檀种子的超低温保存,缓慢冷冻法更适合猪屎豆种子的超低温保存,快速冷冻法适合于决明种子、灰毛豆种子和含羞草种子的超低温保存。由此可知,液氮超低温冷冻法保存降香檀等五种豆科药用植物种子是可行的。     

单抗清除瘤细胞后人骨髓的冷冻保存研究

本实验研究了用CD10类单克隆抗体55(McAb55)与兔补体结合的方法清除骨髓中普通型急性淋巴细胞白血病抗原(CALLA)阳性细胞后骨髓的冷冻保存问题。结果表明:①清除处理对人骨髓的粒单系集落培养(GM-CFU-C)无明显影响;②经过冷冻贮存的样品的GM-CFU-C少于未经冻存的样品;③清除瘤细胞后的样品冻存后与未经清除处理的正常骨髓样品冻存后的GM-CFU-C无显著差别;④影响冷冻保存后骨髓GM-CFU-C的重要因素是冷冻速率;⑤在本实验条件下以0.5℃/min速率降温效果最佳,冻后GM-CFU-C无改变,冷冻损伤主要发生于-40℃以前,降温至-40℃或～80℃后再快速降温影响不明显。此研究为用McAb55加兔补体清除骨髓中CALLA阳性细胞后骨髓的冷冻保存提供了依据。     

用于饮料中山梨酸钾快速测定的负压液芯波导增强拉曼光谱技术研究

以Teflon AF材质的液芯波导管为核心部件,构建了负压液芯波导增强型拉曼检测系统,可以高效消除液芯光路中液体样品的气泡干扰,有效保障液芯波导长光程的拉曼增强作用。在此基础上,开发了功能饮料中食品添加剂山梨酸钾的现场快速检测方法,最低检出限（LOD）为0.05g/kg,加标回收率在98%~105%之间。同时,为了进一步降低负压液芯波导增强型拉曼检测系统对山梨酸钾的LOD,本研究利用冷冻富集技术对样品进一步浓缩,加入20.5g/kg氯化钠后,经过静态冷冻30min、离心冷冻10min的冷冻富集处理,山梨酸钾的LOD可以达到0.005g/kg,方法的日内和日间稳定性（RSD）在3%~4%之间,实际样品检测的加标回收率在94%~106%之间。