华癸中生根瘤菌质粒复制基因repC的克隆与鉴定

摘要：【目的】repC为质粒复制必需的起始蛋白基因。本研究旨在对华癸中生根瘤菌菌株HN3015及其质粒消除突变株进行repC基因的克隆和鉴定。【方法】采用通用引物RC1和RC3进行repC基因的PCR扩增,扩增产物克隆到载体pMD-18T,然后测序。利用Southern 杂交对repC基因定位。利用在线软件分析基因的序列特征,BLAST 工具进行同源性搜索;ExPASy推断其氨基酸的序列;ClustalW进行同源核苷酸和氨基酸序列的多重比较分析;PredictProtein 进行蛋白二级结构分析。【结果】     

大豆BAC克隆基因注释

根据来源于大豆BAC克隆库中的基因组序列,与其比对的基因或蛋白质序列可以从一些数据库中搜索,如GenBank序列数据库、EMBL数据库、PDB数据库等,然后利用NCBI的Entrz程序在数据库中搜索大豆基因类似物,获取其登录号及核苷酸序列,以及这些基因编码的氨基酸序列,通过GENSCAN等软件分析,得出的是与拟南芥等物种序列比对的结果,根据GENSCAN的预测结果,可以初步得知序列长度、基因数目及具有编码某种功能蛋白的基因存在的可能性,进而对预测出的氨基酸或核苷酸序列利用数据库NCBI中的BLAST进行序列的相似性搜索及比对分析,寻找其保守区域。最后对其功能基因进行注释。     

miR-171基因家族进化分析及靶基因预测

运用生物信息学方法在miRBase中搜索植物miR-171基因家族的序列,分析miR-171序列的进化特征并预测其靶基因。结果表明,在38种植物中共搜索到219条miR-171序列,大部分miR-171基因都存在于基因间隔区。进化分析表明,miR-171基因家族的进化与物种进化关联不大。采用3个miRNA靶基因预测软件对大豆和玉米miR-171基因的靶基因进行预测,发现了miR-171可能参与生长因子、转录因子、蛋白酶等的调控,作用范围非常广泛。     

大豆miR-171基因家族的进化与功能分析

运用生物信息学方法在miRBase搜索大豆miR-171(gma-miR-171)基因家族的序列,分析gma-miR-171序列的进化特征并预测其靶基因。结果表明,在miRBase中共搜索到21条gma-miR-171基因家族序列。序列分析发现,gma-miR-171基因家族序列保守性较差,只有2个碱基完全保守。对gma-miR-171基因进行定位,21个成员分散在12条染色体上,其中Chr06上gma-miR-171基因最多,共4个。进化分析表明,位于同一条染色体上的gma-miR-171基因没有表现出较近的亲缘关系。靶基因预测获得14个gma-miR-171基因家族的靶基因,包括蛋白激酶、磷酸酶、输出蛋白、转录因子等,说明gma-miR-171基因家族在大豆中具有广泛的调控功能。     

水稻线粒体丝氨酸羟甲基转移酶基因的电子克隆

采用基于EST的电子克隆方法得到了一段长1611bp的cDNA序列,以此为信息探针搜索HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的基因组DNA序列——OSJNBa0057G07克隆。用FGENESH分析该克隆中的联配区域得到一个包含14个外显子和13个内含子的基因。该基因位于水稻第3染色体物理图谱的136．0～137．6cM区域。推导的ORF编码498个氨基酸,经BLASTP搜索SWISS-PROT数据库和蛋白序列的亚细胞定位显示,该基因编码水稻的线粒体丝氨酸羟甲基转移酶(mSHMT)。该基因受到EST序列的完全支持,其中不乏来自盐胁迫、稻瘟病菌侵染等逆境处理的EST序列,推测该基因与水稻对逆境的应答反应有关。     

miRNA-9基因家族进化分析及其靶基因预测

microRNAs(miRNA)是真核生物中一类长度约为21～25个核苷酸的非编码小分子RNA,在转录后水平调控基因的表达。该文在miRBase中搜索后生动物的mir-9基因序列。47个物种中共搜索到120条mir-9基因序列,说明mir-9基因家族广泛存在于不同物种中。基因定位显示86%的mir-9基因存在于基因间隔区(IGR),多序列比对发现miR-9基因家族成熟序列的第2位到第8位碱基以及第14位到第18位碱基为保守碱基。进化分析表明mir-9b和mir-9c可能是此基因家族最早出现的基因形式,即祖先基因。这些祖先基因经过串联重复、大片段重复、个别碱基的缺失及突变等方式形成了脊椎动物中miR-9-1至miR-9-7数个基因。分别采用四个miRNA靶基因预测软件对mmu-miR-9的靶基因进行预测,发现miR-9与神经系统发育、心肌系统疾病和跨膜运输系统等密切相关。该研究为今后进一步研究miRNA调控的神经系统发生和神经细胞生长与分化的机制奠定了基础。     

水稻Ac×Ds后代基因组DNA中Ds侧翼序列的扩增及其Ds插入分析

采用TAIL-PCR技术从经鉴定含Ac/Ds双元件的材料中扩增Ds侧翼序列并测序, 对水稻Ac×Ds后代基因组DNA进行Ac和Ds插入的PCR分析。利用NCBI的BLAST软件, 以Ds侧翼序列为待查询序列进行GenBank在线搜索比对, 获得Ds插入相关基因的染色体定位和功能注释等信息。对扩增的93个有效Ds侧翼序列进行分析, 结果显示, 有21个水稻杂交后代中Ds插入于基因编码区, 其余72个插入在基因间序列, 其中12个插入在特定基因的上游3 kb以内的间隔区。本研究强调了提高Ds侧翼序列扩增和Ac/Ds植株筛选效率的技术关键。     

12S rRNA和Cyt b基因序列测定在獐乳制品鉴定中的应用

采用改良的蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提的方法从脂肪含量很高的动物乳制品及胃组织中提取出基因组总DNA,利用特异引物扩增了线粒体12S rRNA基因和Cyt b基因的部分片段,测定了12S rRNA和Cyt b基因的PCR扩增产物序列,使用BLAST搜索软件将其序列与GenBank中的同源序列进行比对,并利用DNAMAN分析软件分析序列同源性。结果表明3件检材均来源于獐Hydropotes inermis。本研究所用方法在野生动物乳制品鉴定中具有较高的应用价值。     

甘蔗ATP合酶基因的电子克隆及生物信息学分析

目的:运用电子克隆的方法获得甘蔗中的ATP合酶基因。方法:以小麦中一个ATP合酶基因为种子序列,对甘蔗的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行聚类分析、拼接组装和延长。结果:获得一个ATP合酶基因SATPC1的cDNA序列全长,该序列长1 415bp,包含一个完整的1 077bp的ORF,编码358个氨基酸,且与水稻、玉米、高粱和葡萄等其他植物的ATP合酶具有高度的同源性。结论:电子克隆获得的cDNA序列为完整的甘蔗ATP合酶基因全长cDNA。     

16S rRNA基因和COI基因序列分析在石斑鱼物种鉴定中的应用

对台湾海峡常见的8种石斑鱼进行了16S rRNA基因和COI基因的序列测定,并通过GenBank和BOLD两个数据库进行鱼种鉴定.序列分析表明,COI基因较16S rRNA基因有更大的分辨率;两个基因序列在GenBank中的搜索结果和COI基因序列在两个数据库的搜索结果大部分一致,但仍有部分差异.建议同时使用COI和16S rRNA两种保守基因,进行序列测定,然后在GenBank和BOLD SYSTEMS数据库进行搜索,选择一致的鉴定物种作为鉴定结果.     

球毛壳菌循环肽HC-毒素基因的序列分析

为了验证Phrap软件是否适合在EST分析中应用,对球毛壳菌循环肽HC-毒素基因进行了序列分析。根据EST分析的结果,从cDNA文库中挑取循环肽HC-毒素基因的克隆进行了测序并序列分析。结果表明cDNA文库中循环肽HC-毒素基因的克隆插入片断大小为1217bp;用Phrap软件拼接出来的循环肽HC-毒素的表达序列标签拼接序列与实际序列不完全一致,因此Phrap软件不适合在EST分析中应用。     

从猕猴肝脏组织扩增黄嘌呤脱氢酶／氧化酶基因片段

RT-PCR扩增猕猴黄嘌呤脱氢酶／氧化酶（XDH／XO）基因片段,为进一步开展相关研究提供实验资料。方法提取猕猴新鲜肝脏组织总RNA,用RT-PCR二步法进行XDH／XO基因片段扩增,对获得的目的片段进行序列测定,与GenBank上发表的人类（Homosapiens）、小鼠（Musmusculus）、家鼠（Rattusnorvegicus）、野猪（Susscrofa）等物种XDH／XO基因进行该序列同源性比对分析,DNAMAN软件预测该段核苷酸的氨基酸序列,Inter-ProScan及SWISS-MODEL工具进行XDH／XO的编码蛋白结构域及功能预测及三维结构构建。结果RT-PCR产物电泳检测得到了与设计大小相一致的目的条带,序列测定共测到683个核苷酸,DNAMAN软件预测该段核苷酸的氨基酸序列包括了1个编码53个氨基酸的开放阅读框（ORF）,通过该软件包中Multiplealignment对目的基因片段的核苷酸序列与NCBI报道的人类、小鼠、家鼠、野猪XDH／XO基因mRNA互补的cDNA核苷酸序列同源性进行同源性比较分析,结果显示所扩增得到的目的片段与人类同源性最高,为95．6％,与小鼠、家鼠、野猪的同源性分别为85．2％、84．3％、86．1％,说明获得的基因片段是猕猴的XDH／XO基因片段,且该基因在物种间具有较高的相似性。生物信息学预测该段XDH／XO编码蛋白含有醛氧化／脱氢酶的钼喋呤结合点结构域及黄嘌呤脱氢酶结构域。结论在体外成功扩增出猕猴XDH／XO基因片段,为进一步开展高尿酸血症致病机理研究,抗高尿酸血症新药研发奠定工作基础。     

马铃薯密码子用法分析及其在t-PA基因密码子改造上的应用

采用bioperl-1.0 工具在红旗LINUX系统下自编了密码子分析软件;通过对马铃薯98个蛋白质编码基因序列（codon DNA sequence）的分析,计算出了马铃薯的密码子用法,并确定出了马铃薯的4个高表达优越密码子;依据马铃薯密码子用法和高表达优越密码子分析结果,对t-PA基因序列进行了密码子的改造,得到了具有马铃薯密码子使用特点的t-PA基因序列,从而为以马铃薯为生物反应器高效生产t-PA奠定了分子基础。 Abstract:Bioperl-1.0 was used under Hongqi LINUX system to programm the codon analysis software.According to the analysis of 98 codon DNA sequences with this software,the codon usage in potato was calculated and 4 codons have been inferred to the optimal codons.The codons of tissue plasminogen activator (t-PA) gene sequence have been reconstructed according to the results.The t-PA gene sequence containing the optimal codons of potato will be used for t-PA production by potato bioreactor.     

弓形虫RH株SAG1基因序列体外扩增及生物信息学分析

根据sAG1基因序列,自行设计一对寡核苷酸引物,利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中成功扩增出编码SAG1抗原的基因片段,扩增出的基因片段大小与预期长度（1006bp）相符,结果经测序验证,并利用生物信息学方法对SAG1蛋白理化性质、结构和功能进行了预测．     

节杆菌A．pascens DMDC12中SOD基因的克隆和序列分析

根据基因库中细菌SOD的基因保守序列和Arthrobacter pascens DMDC12的N-末端氨基酸序列设计引物,采用PCR技术,以A.pascens DMDC12基因组为模板,克隆了A.pascens DMDC12中Mn-SOD的567 bp的基因片段;再结合该基因片段和A.pascens DMDC12中SOD的N-末端氨基酸序列的有关信息,设计包含该sod完整ORF区域的引物,成功扩增了A.pascens DMDC12中Mn-SOD的基因序列,新sod序列(sodAP)已提交Gen-Bank(收录号DQ779150)。利用生物学软件对该序列进行分析表明,该sodAP序列的ORF区域全长651 bp,编码216个氨基酸;该序列和Arthrobacter sp.FB24的SOD基因序列同源性为86%。     

三角帆蚌Nacrein基因克隆、蛋白提纯及其对珍珠晶体成型的影响

为研究三角帆蚌Nacrein蛋白对珍珠晶体成型的影响,通过巢式及3′-RACE PCR对三角帆蚌基质蛋白Nacrein基因3′端序列进行克隆,得到850bp碱基片段,分析表明其与合浦珠母贝同源基因序列相似度为56%,与马氏珠母贝相似度为50%。试验通过水提法初步分离出珍珠质水溶性基质蛋白,并采用快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)分离出分子量约为60kD的Nacrein蛋白。此外,采用配对试验设计,对试验组外套膜组织培养样品加入Nacrein蛋白,研究Nacrein蛋白对晶体成型的影响,结果显示,加入Nacrein蛋白的试验组结晶成棱形状;而未加Nacrein蛋白的对照组结晶成雪花状,而且在晶体形成的时间上,试验组也较之对照组要早。研究表明,Nacrein蛋白能加速外套膜组织分泌的钙质形成棱状结晶,从而对晶体成型产生影响。本研究为进一步研究基质蛋白对生物矿化的作用提供试验依据,对珍珠培育生产有一定指导意义。     

羊驼催乳素基因cDNA克隆及序列分析

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示。从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断。测序后在NCB I工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。。     

Mutation detection in the human HSP7OB' gene by denaturing high-performance liquid chromatography

Variances, particularly single nucleotide polymorphisms (SNP), in the genomic sequence of individuals are the primary key to understanding gene function as it relates to differences in the susceptibility to disease, environmental influences, and therapy. In this report, the HSP70B' gene is the target sequence for mutation detection in biopsy samples from human prostate cancer patients undergoing combined hyperthermia and radiation therapy at the Dana-Farber Cancer Institute, using temperature-modulated heteroduplex analysis (TMHA). The underlying principles of TMHA for mutation detection using DHPLC technology are discussed. The procedures involved in amplicon design for mutation analysis by DHPLC are detailed. The melting behavior of the complete coding sequence of the target gene is characterized using WAVEMAKER software. Four overlapping amplicons, which span the complete coding region of the HSP70B' gene, amenable to mutation detection by DHPLC were identified based on the software-predicted melting profile of the target sequence. TMHA was performed on PCR products of individual amplicons of the HSP70B' gene on the WAVE Nucleic Acid Fragment Analysis System. The criteria for mutation calling by comparing wild-type and mutant chromatographic patterns are discussed.     

人B组轮状病毒vp7基因的克隆和序列分析

利用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增了人B组轮状病毒WH—2vp7基因,连接到克隆载体pUCm—T,并对其基因序列进行了分析。WH—2与ADRV的同源性达98％,与印度加尔各达分离株CAL—1达92％,而与动物B组轮状病毒同源性差别较大,如与IDIR(鼠)同源性仅为58％,与WD653(牛)B组轮状病毒同源性为63％,与ATI(牛)同源性为61％。对vp7基因的二级结构分析发现其mRNA折叠形成多达18个发卡环状结构。VP7蛋白是249个氨基酸组成,分子：量为28．4kDa,含有3个潜在的N连接的糖基化位点和多个磷酰化位点,从氨基酸序列的同源性来看,WH—2与ADRV的同源性达99％,与CAL—1达95％,而IDIR仅为51％,说明了WH—2和ADRV的起源相同。此研究对了解B组轮状病毒基因的进化和变异规律具有重要意义,也将为B组轮状病毒预防性疫苗的研制提供科学的依据。     

Isolation and Characterization of a Novel Noncoding RNA from Nickel-Induced Lung Cancer

Noncoding RNAs have drawn significant attention in carcinogenesis. In this study, we identified a novel gene named nickel-related gene1 (NRG1) associated with nickel-induced cancer. By using rapid amplification of cDNA end PCR, we obtained the full length of the cDNA. The sequence was analyzed by using related bioinformatics software and comparative genomics methods. The results showed that NRG1 was located on chromosome 2q12, within intron2 of ADAMTS6, a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs. And, NRG1 had a high level of homology (76?%) to rat LINE1 sequence RL1.3 (long interspersed middle repetitive DNA). What's more, there was no continuous open reading frame present in NRG1 sequence. Taken together, these data demonstrate that NRG1 is a novel noncoding RNA, and we predicted it may be a transposon-like gene. The identification of NRG1 emphasized the potential role of noncoding RNA in nickel carcinogenesis.