不同土壤类型和含水量下金龟子绿僵菌对红火蚁的致病力

[背景]红火蚁是一种危险性入侵生物,虫生真菌对其防治效果会受到外界环境因子的影响。[方法]应用致病力测定的方法研究了不同剂量金龟子绿僵菌M09对红火蚁的毒力,同时研究了含水量和土壤类型对绿僵菌毒力的影响。[结果]红火蚁的死亡率与金龟子绿僵菌的剂量呈正相关,处理4d后LG50为0．37g。金龟子绿僵菌在砂土、壤土和粘土中对红火蚁的致死率均与对照差异显著,其中在砂土中的毒力最强。此外,在不同含水量的土壤中,金龟子绿僵菌的致死率也不相同（P〈0．01）。[结论与意义]土壤类型和土壤湿度会显著影响金龟子绿僵菌M09对红火蚁的防治效果。选择高湿和砂土类型的土壤施用金龟子绿僵菌M09可以达到较好的效果。     

三株金龟子绿僵菌对红火蚁的致病力测定

本研究在实验室条件下测定了金龟子绿僵菌M09、CQMa117和CQMa128三个菌株对红火蚁的侵染能力。结果表明在1.0×10~8孢子/mL浓度下M09、CQMa128和CQMa117菌株处理后10 d红火蚁的工蚁累计死亡率分别为73.3%、14.6%和55.5%;M09菌株对工蚁的LC50为3.50×106孢子/mL,8.0×107孢子/mL浓度处理LT50为4.35 d。对M09菌株侵染红火蚁幼虫和蛹的能力测定结果显示,1.0×10~8孢子/mL浓度处理后10 d该菌株对幼虫和蛹的累计侵染率为98.9%和100%,对幼虫和蛹LC50分别为6.34×10~4孢子/mL、1.01×10~4孢子/mL。以上研究证实金龟子绿僵菌M09菌株对红火蚁具较强的致病力,致死速度较快,可作为该蚁生物防治的候选菌株。     

金龟子绿僵菌MaYTTR-04菌株对松墨天牛成虫的致病力

松墨天牛Monochamus alternatus Hope是重大森林植物检疫性病害——松材线虫病的主要媒介昆虫。采用跗节接种法测定金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae MaYTTR-04菌株对松墨天牛成虫的致病力。结果表明： 在恒温条件下,松墨天牛第6天开始死亡,第18天～21天为死亡高峰期,每头成虫接种孢子量为2.3×10⁶±0.2×10⁶时成虫的死亡率第18天达85%,第21天达95%; 时间效应指标值LT₅₀为14.7天。室内自然变温条件下,松墨天牛第3天出现死亡,第15天～21天为死亡高峰期,每头成虫接种孢子量为2.3×10.6±0.2×10⁶时的死亡率在第15天达85%,第21天达100%;时间效应指标值LT₅₀为12.9天。林间套笼21天后,菌液处理的成虫平均死亡率为60%,僵虫率为48.9%;而通过无纺布菌条的成虫死亡率为86.7%,僵虫率为75.6%。表明MaYTTR-04菌株对松墨天牛成虫有强的致病力,且在较高变温环境温度下致病力更强。结果说明该菌株可作为生产性菌株应用于林间防治松墨天牛。     

金龟子绿僵菌原生质体形成和再生的研究

用0.5%纤维素酶和0.5%蜗牛酶的混合酶液,以0.6mol/L KCl为渗透压稳定剂,pH6.5时,30℃处理菌龄为24小时的金龟子绿僵菌3-4小时,可从1克湿菌丝获得5×10⁷个以上的原生质体。原生质体在祭氏培养基上再生率仅为0.1—1.2%。但原生质体先在液体中培养再转移到固体平皿上,再生率可提高到8%。实验还观察和确证了原生质体的形成及其再生。     

红火蚁Serpin家族基因鉴定及其在绿僵菌侵染下的表达模式分析

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor, Serpin）在昆虫Toll通路和PPO级联反应的防御机制中起着至关重要的作用。本研究利用现代生物信息学工具预测和分析了红火蚁Solenopsis invicta中Serpin家族的结构和功能多样性。染色体定位表明,红火蚁基因组中7个Serpin基因家族成员不均匀的分布在4条染色体上。结构域分析表明,SiSerpin蛋白具有Serpin基因的保守结构,即典型的反应中心环（Reactive central loop, RCL）结构与Serpin结构域,不同成员蛋白拥有多样化的基序。系统进化分析表明,红火蚁Serpin蛋白与其他的昆虫Serpin蛋白有较高亲缘关系,SiSerpin7与烟草天蛾Manduca sexta的Serpin3a亲缘关系最近,SiSerpin12与黄粉虫Tenebrio molitor Serpin55亲缘关系最近,SiSerpin13与烟草天蛾Serpin6亲缘关系最近,SiSerpin4与家蚕Serpin27亲缘关系最近。为了进一步明确红火蚁Serpin家族在绿僵菌Metarhizium侵染后的表达模式,用绿僵菌侵染不同体型的工蚁,荧光定量PCR（RT-qPCR）分析表明,红火蚁Serpin基因家族成员能在早期响应绿僵菌的侵染;除SiSerpin7基因外,大型和小型两种工蚁的表达模式存在较大的差异。结果表明红火蚁Serpin家族作为免疫调控蛋白,能够响应绿僵菌的侵染,且在红火蚁不同体型工蚁之间存在着不同的免疫调控模式。这些发现不仅为Serpins的功能分析提供了理论基础,而且有可能有助于绿僵菌作为一种有效的生防剂的开发。     

绿僵菌属的一个新种

本文报导从贵州省贵阳罹病梨虎Rhynchites Coreanus Kono幼虫虫尸分离的一种绿僵菌新种的鉴定结果,该菌与绿僵菌属模式种金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae (Metsch) s-orkin 有明显区别,根据菌落颜色、分生孢子团块大小、连接紧密和牢固程度、孢子链连接方式和分生孢子形态等,我们鉴定为新种——翠绿绿僵菌Metarhizium iadini chen、Guo et zhou sp.nov.     

感染松墨天牛的金龟子绿僵菌菌株的初步筛选

松墨天牛是松材线虫病的主要媒介昆虫,本文对分离自松墨天牛的6株金龟子绿僵菌,以及从光肩星天牛、大蜡螟、伊藤厚丝角叶蜂和土蝽上分离的各1个菌株,共10个菌株的产孢情况、孢子萌发率进行研究;在此基础上选出金龟子绿僵菌1291、1349和2049三个菌株及球孢白僵菌F-263菌株,采用成虫跗节接种法和幼虫浸渍法进行室内松墨天牛及大蜡螟的毒力测定比较。结果表明,供试绿僵菌菌株对松墨天牛幼虫在接种15天后的感染僵虫率为76.9％～93.1％(1×10⁷孢子/mL);成虫在接种20天后的僵虫率亦达57.9％～75.0％(6.5×10⁵～3.4×10⁶孢子/成虫);2049菌株表现尤其突出;对应的球孢白僵菌F-263对幼虫和成虫的僵虫率分别是96.3％(1×10⁷孢子/mL)和55％(9.7×10⁵孢子/成虫)。但这3个金龟子绿僵菌菌株对大蜡螟的毒力较低,存在较明显的寄主专化性。这3个菌株今后在防治松墨天牛方面具有较大开发应用价值。     

金龟子绿僵菌固态培养生物变量优化研究

金龟子绿僵菌属于真菌类生物杀虫剂,本文研究了接种量、种龄、菌种代数等生物因素对金龟子绿缰菌生长及产孢量的影响,并对液-固两步发酵工艺进行了研究.经过优化,得到金龟子绿僵菌产孢的最佳生物参数是:接种量为2.5g/100g、种龄为5～6天;采用固体二代种,培养6天,孢子产量可达1.531×1010孢子/g干培养基.     

草地贪夜蛾高致病力绿僵菌菌株的筛选与鉴定

为获取对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda具有高致病力的生防真菌,从福建省不同地区分离得到8株寄主为鳞翅目和半翅目幼虫僵虫的绿僵菌Metarhizium,采用浸渍法测定了其对草地贪夜蛾2龄幼虫和蛹的致病力,并根据形态学和分子生物学方法对高致病力菌株进行种类鉴定。结果表明,8株绿僵菌菌株对草地贪夜蛾2龄幼虫和蛹均表现出不同程度的致病力,其中菌株FJMR2和FJXY7表现出较强的致病力。在5×107个/mL孢子浓度下,FJMR2和FJXY7对草地贪夜蛾2龄幼虫的致死率分别为88.76%和82.13%,对蛹的致死率分别为86.57%和84.00%;对草地贪夜蛾2龄幼虫的LT50分别为4.81 d和4.93 d,对蛹的LT50分别为4.94 d和4.83 d。经鉴定菌株FJMR2和FJXY7均为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi。本研究获得2株对草地贪夜蛾2龄幼虫和蛹具有高致病力的莱氏绿僵菌菌株,在草地贪夜蛾的生物防治中具有较大应用潜力。     

绿僵菌属的三个新种

作者从广东、贵州、北京等地收集的虫生真菌中,发现在我国具有绿僵菌属特征的真菌可分为四个种。根据菌落颜色、分生孢子团块大小、紧密和牢固程度、孢子链连接方式、分生孢子形状等,将我们收集的属于本属的菌株分为四个种。本文报道绿僵菌属三个新种的描述。金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae(Metsch.)Sorokin为最常见的甘蔗金龟子致病菌,是本属的模式种。平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense Chen et Guo sp.nov.、柱孢绿僵菌Metarhizium cylindrosporae Chen et Guo sp.nov.和贵州绿僵菌Metarhizium guizhouense Chen et Guo sp.nov.是三个新种。     

黄氏枝膜叶蜂生物学特性及金龟子绿僵菌对其幼虫的致病力

【目的】黄氏枝膜叶蜂Cladiucha huangbki是新发现的叶蜂科(Tenthredinidae)枝膜叶蜂属Cladiucha种类,以幼虫取食危害乳源木莲Manglietia yuyuanensis叶片,虫口密度大, 严重影响乳源木莲的生长。本研究旨在明确该虫的生物学特性,并筛选出对该虫具有高致病力的金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae菌株,为高效治理该虫提供理论基础和生物防治资源。【方法】以林间调查和室内饲养观察相结合的方式,观察黄氏枝膜叶蜂的各发育阶段形态特征和生物学特性(寄主植物、分布和生活史);采用孢子悬浮液喷雾法筛选高致病力金龟子绿僵菌菌株。【结果】林间和室内观察结果表明,黄氏枝膜叶蜂幼虫取食木兰科木莲属植物,在福建永安市一年发生1代,以老熟幼虫(预蛹)在土室中越夏、越冬;翌年3月上旬化蛹,3月下旬成虫羽化,4月上旬为雌虫产卵高峰期,4月中旬幼虫出现,4月下旬至5月上旬为幼虫危害高峰期,5月中旬老熟幼虫开始入土做土室,入土深度30~150 mm。室内金龟子绿僵菌不同菌株对黄氏枝膜叶蜂幼虫致病力测定结果表明,以1×10⁷孢子/mL悬浮液喷雾11 d后,不同菌株对其幼虫的校正死亡率均超过85%,其中MaQZ-01, MaYTTR-04-05, Ma3和MaFZ-13 4个菌株感染的叶蜂幼虫校正死亡率为100%。菌株MaFZ-08感染引起的黄氏枝膜叶蜂僵虫率最高,为60%;其次是MaYTTR-04-05,引起的僵虫率为50%。金龟子绿僵菌各菌株对黄氏枝膜叶蜂幼虫的致死中时间(LT₅₀)相差不大,在6 d左右,其中MaYTTR-04-05菌株的LT₅₀最短,为5.090 d。【结论】黄氏枝膜叶蜂在福建永安一年发生1代,5月中、下旬老熟幼虫入土做土室化为预蛹越夏越冬。本研究筛选出对黄氏枝膜叶蜂幼虫致病力强的金龟子绿僵菌MaYTTR-04-05菌株,在其防治上有良好的应用前景。     

感染水椰八角铁甲的绿僵菌的分子鉴定及致病力测定

在室内饲养的水椰八角铁甲Octodonta nipae(Maulik)种群中,发现有大量甲虫被病原菌感染致死.对死虫体表的病原真菌进行分离鉴定,并依据ITS序列分析鉴定,确定该病原真菌为金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var.anisopliae).经室内致病力测定,接种浓度分别为1...     

用Real-Time PCR评价花生田间金龟子绿僵菌的存活能力

为了能够对金龟子绿僵菌在花生田间的存活能力进行精确的定量研究,通过比对真菌ITS序列,设计出针对金龟子绿僵菌的特异性引物,并建立金龟子绿僵菌Real-Time PCR反应体系。结果表明,标准品在拷贝数为8.49×103–8.49×109copies/μL之间,线性关系良好,线性方程为y=-3.257x+6.969,相关系数为R=0.9980,扩增效率E=102.8%,检出痕量为20个孢子/g土壤。以Real-Time PCR方法和平板稀释法,分别对花生根部施用金龟子绿僵菌后不同时期的土壤进行定量分析,结果表明两种方法检测的金龟子绿僵菌数量变化趋势相似,施用的金龟子绿僵菌在根围与根际都呈现先快速下降后缓慢回升的趋势,90d时金龟子绿僵菌DNA量和CFU值均下降至初始的10%以下,之后出现回升;根际的金龟子绿僵菌相对地下降较慢而回升较快,在120d时可恢复到初始的52.17%和38.65%,显著高于根围的数量。试验建立的Real-Time PCR体系可用于金龟子绿僵菌土壤宿存的定量检测,而且适用于低含量的检测。     

红火蚁Toll受体家族免疫响应绿僵菌表达模式的研究

为探究红火蚁Solenopsis invicta Buren Toll受体家族基因如何免疫响应绿僵菌Metarhizium的侵染。本研究采用浸渍法测定了不同浓度下绿僵菌对红火蚁大中小3种不同大小工蚁的致病力,并用显微镜观察了绿僵菌侵染后红火蚁3种工蚁的表型变化。利用生物信息学筛选Toll受体基因,并对Toll受体家族基因的理化性质、结构域、染色体位置、系统进化进行分析鉴定。运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了红火蚁大中小型工蚁中Toll受体家族的发育历期和绿僵菌侵染后的表达模式。结果表明,绿僵菌在96 h对红火蚁大中小型工蚁的致死中浓度（LC50）分别为5.8×10^7孢子/mL、3.1×10^7孢子/mL、1.5×10^7孢子/mL;绿僵菌侵染红火蚁第3天,显微镜下观察到红火蚁体壁细小的菌丝,虫体僵硬,寄主死亡后菌丝迅速蔓延并逐渐长成橄榄绿色分生孢子;RT-qPCR结果表明Toll受体基因在红火蚁不同发育阶段中的mRNA表达水平存在显著差异,且Toll受体基因在雌性生殖蚁表达水平显著高于雄性生殖蚁;RT-qPCR结果表明红火蚁大中小型工蚁Toll受体免疫响应绿僵菌不一样。在大型工蚁中,绿僵菌侵染后,Toll受体家族基因能显著上调表达,6 h是一个诱导高峰期,Toll2-1和LRR转录水平最高,响应绿僵菌最强;在中型工蚁中,绿僵菌不能刺激Toll2-2基因的表达,却能强烈诱导Toll1,Toll2-1,Toll6,Toll7和LRR基因的上调表达,Toll1和Toll2-1响应绿僵菌最强。在小型工蚁中,绿僵菌能显著诱导Toll受体家族基因基因的上调表达,在24 h时,LRR基因表达量最高,相比于对照,LRR基因表达提高25倍,LRR在6 h和24 h响应绿僵菌最强。以上研究表明Toll受体可以免疫响应入侵的绿僵菌,且不同的Toll对绿僵菌可能具有不同的响应机制。本研究为进一步阐明Toll受体的功能奠定基础,为进一步利用绿僵菌控制红火蚁提供技术指导。     

不同来源绿僵菌对云斑金龟蛴螬致病力评价

以云斑金龟蛴螬为检测昆虫,检测了不同来源的6株金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）菌株,结果认为,以RAW8菌株对云斑金龟蛴螬的致病力最强。     

精胺合成酶MrSPS参与调控罗伯茨绿僵菌的生长发育、抗逆和致病力

本研究以罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii为研究对象,针对鉴定出的精胺合成酶基因(MAA_02088, Mrsps),利用农杆菌介导的同源重组方法获得Mrsps敲除株ΔMrsps。与野生型相比,ΔMrsps营养生长和产孢能力下降,对氯化钠和紫外照射耐受性增强。大蜡螟幼虫毒力分析表明,浸渍和注射两种情况下ΔMrsps致病力降低,半致死时间(LT₅₀：6.71和4.75 d)比野生型(LT₅₀：5.17和4.19 d)显著增加。Mrsps敲除后不影响附着胞形成率和蝉翅穿透能力,但会显著下调昆虫血腔定殖相关基因的表达量。这些结果说明精胺合成酶MrSPS参与调控罗伯茨绿僵菌的生长发育、外界胁迫应答和致病力。     

金龟子绿僵菌固态发酵产壳聚糖酶

对金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）AS3．4606产壳聚糖酶进行了固态发酵条件优化及酶学部分特征的研究。正交实验结果表明,以麸皮为碳源,日本根霉菌丝体粉末为氮源,在起始pH5．0,m（碳）：m（氨）为1：4,m（干重）：m（液体）为1：1．4,27℃下培养120h,壳聚糖酶活性可达35．08U／g（干培养基）。粗酶液的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5．0,酶在pH5．0～6．0条件下稳定性最高。该酶不能水解固体甲壳素和纤维素粉末,最适底物为胶体壳聚糖。     

一株绿僵菌的分离研究

利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基,对一株绿僵菌进行了分离培养。对不同生长发育天数的菌落特征即颜色、大小、孢子堆的形成等特点进行了描述。在光学显微镜下观察了菌丝的形态,成熟孢子及分生孢子梗的形状、颜色及连接状况。利用扫描电镜观察了分生孢子和孢子梗的超微形态。经培养特征和形态学鉴定,确定该昆虫病原真菌是金龟子绿僵菌。     

绿僵菌对小麦纹枯病菌的抑制作用研究

在实验室条件下,研究了金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）对小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的拮抗作用及其机理。结果表明,金龟子绿僵菌与小麦纹枯病菌对峙培养以及在培养基中加入金龟子绿僵菌孢子悬浮液,对小麦纹枯病菌菌丝生长均有较好的抑制作用。测定了培养不同天数的金龟子绿僵菌Ma55发酵液对小麦纹枯病菌菌丝生长、菌核产生量及菌核萌发率的影响。结果表明,液体振荡培养25 d的金龟子绿僵菌Ma55发酵液对小麦纹枯病菌的菌丝生长、菌核产生量及菌核萌发具有显著的抑制作用,且Ma55发酵液中的抑菌活性物质具有较好的热稳定性。在光学显微镜下,未观察到Ma55对小麦纹枯病菌的重寄生现象,但发现金龟子绿僵菌与小麦纹枯病菌对峙培养处小麦纹枯病菌营养菌丝的细胞质变稀薄、菌丝部分消解或断裂。上述结果显示,金龟子绿僵菌对小麦纹枯病菌的拮抗机制主要是营养竞争、空间竞争及抗生作用等。     

金龟子绿僵菌菌株生长环境变量的优化

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)是一种广谱的昆虫病原真菌,提高菌株的生长速率及产孢量具有重要的意义.分别对2株金龟子绿僵菌菌株MA4与MAlml的菌丝生长及次代产孢具有影响的培养温度、培养基初始pH、装液比、光照及微量元素等环境因素进行了测定.经过优化得到2菌株最佳培养条件分别为:MA4菌株在28℃、pH 7、装液比为75ml/250ml、加入微量元素Mn全光照培养时生长最好、次代产孢量最高;MAlml菌株在28℃、pH9、装液比为75ml/250ml、加入微量元素Cu、黑暗培养时生长最好、次代产孢量最高.