一种产黄青霉突变体库的简单快速构建方法

产黄青霉(Pennicillium chrysogenum)是重要的工业丝状真菌,为更好地提高青霉素产量,了解青霉素合成的调控途径及相关基因的功能,突变体库的构建是一种有效途径。本研究以PCR扩增得到的T-DNA片段为外源DNA,通过PEG介导转化至产黄青霉原生质体中,成功地将含有外源博来霉素抗性基因(ble)和绿色荧光蛋白基因(gfp)的T-DNA插入到产黄青霉基因组中,构建了产黄青霉突变体库,并实现了ble基因和gfp基因在产黄青霉中的表达。该方法不依赖于农杆菌介导,无需构建二元表达载体,只需一步PCR即可实现外源基因的制备,简单快速,也为研究其它真菌基因功能和突变体库构建提供参考。     

产黄青霉病毒的稳定性和体内病毒的滴定度

产黄青霉(penicillium chrysogenum)病毒(PcV)在0.02M、pH 7.0磷酸缓冲液(4℃)中经乙醚、氯仿、0．1％SDS、甲醛等处理和一20℃冻融及4℃下保存230天以上均仍保持抗原性。但用0．5一1％SDS处理和5次以上反复冻融便全部丧失或只保留极微弱的抗原性。随着保存时间延长抗原性逐渐降低,在凝腔电泳中两区带间隔和迁移率明显增加。     

米曲霉中的一种新病毒与其它真菌病毒的血清型比较

自α-淀粉酶生产菌米曲霉Aspergillus oryzae 3800中找到直径20～24nm的等轴病毒颗粒(AoV),病毒具有典型核蛋白吸收峰,最大E258,最小E242,E260/280=1.36,沉降系数为45S,一个电泳组分,毒粒对氯仿敏感,细胞内含量低,病毒核酸电泳一个组分,地衣酚反应阳性,SDS-不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳解离病毒得到分子量为17,800道尔顿的一个主要衣壳多肽。 AoV与小麦全蚀病菌病毒(GgV)的几个衣壳多肽及分子量不同的分离物间有共同的抗原性,而与产黄青霉病毒和同属的黑曲霉病毒不同,这是真菌寄主分类地位较远的病毒间有共同抗原性的不常见例子。     

一种适合PCR反应的产黄青霉基因组简易提取方法

为同时高效地对大量产黄青霉(Penicillium chrysogenum)突变株进行分子鉴定,本实验探索了一种适合PCR反应的简易产黄青霉基因组提取方法。该方法首先将产黄青霉菌丝转移至0.7 mol/L Na Cl为等渗剂的蜗牛酶(6 mg/m L)和纤维素酶(4 000 U/m L)酶解液中,超声波处理10 min,然后于28℃酶解14 h,最后95℃加热处理10 min。结果表明,应用该方法获得的裂解液上清稀释后可直接作为PCR反应模板,且扩增条带清晰。该方法操作简便,用样量小,可在96孔板一个孔中完成DNA模版的制备过程,并且可同时并行多个样品,适于大规模产黄青霉基因工程突变株的检测,并为其它真菌基因组的提取提供了参考。     

展青霉和产黄青霉的种间体细胞杂交I. 原生质体融合、杂种发育和诱发分离1)

青霉菌属束状青霉亚组(Subsection Fasrirulata)的展青霉(P. patulum)和绒状青霉亚组(Subsection Velutina)的产黄青霉(P. chrysogenum),通过原生质体融合杂交获得成功。融合频率为0.06—0.14％,异核体能发育成为杂种的有3—10％。杂种菌落为深浅不同的暗红色、灰绿色。杂种生长旺盛,产生深红至褐色色素及少量孢于。根据原养型菌落形态、孢子大小及分离子表型,认为杂种是种间非整倍体或二倍体。     

曲霉属种间原生质体融合后病毒传递及遗传重组——Ⅱ.黑曲霉与米曲霉种间杂交

感染直径28-33纳米球形病毒的葡糖淀粉酶生产菌黑曲霉与无病毒生长较快的米曲霉通过原生质体融合杂交,获得两种形态不同的种间杂种。杂种Ⅰ经遗传及生化分析推测是二倍体,杂种Ⅱ不产孢子并生长较慢。两个杂种均感染了病毒,病毒形态、血清反应、衣壳多肽及核酸组份均与亲本黑曲霉的病毒相同。杂种诱发分离的后代中,多数包括亲代型黑曲霉分离子及其它分离子均感染了病毒,只有一个分离子和来自异核体的一个分离物例外,二者均产生亲代型米曲霉类型的孢子。这种亲代型分离表明病毒种间传递并非胞质遗传。 黑曲霉与米曲霉分属黑曲霉群及黄曲霉群,是曲霉属内亲缘关系远的种间杂交,迄今并无报道。杂种Ⅰ具有接近原始亲本的葡糖淀粉酶的产量及米曲毒的生长速度。     

植物精油对金针菇保鲜效果的研究

为开发天然绿色的食用菌专用型保鲜剂,对4种植物精油抑制黑曲霉(Aspergillus niger)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、绿色木霉(Trichoderma viride)和木霉(Trichoderma sp.)等病原真菌的效果进行分析,并以金针菇为材料进行初步保鲜效果评价。研究结果显示,薰衣草精油对黑曲霉的抑制率最高,为17.86%,柠檬醛对产黄青霉及木霉的抑制率最高,分别为16.69%和34.41%,而茴香油则对绿色木霉的抑制率最高,达17.39%。经柠檬醛处理的金针菇在保鲜过程中,失重率、褐变度被显著抑制,还原糖含量增加,CAT活性降低的趋势被减缓。这些指标均显示柠檬醛具有较好的保鲜效果,是开发天然绿色保鲜剂的良好材料。     

分离自冬虫夏草可培养真菌的多样性研究

冬虫夏草是生长于青藏高原的一种名贵中药材。天然冬虫夏草及其微环境中生活着多种真菌。作者使用常规分离培养方法对冬虫夏草的真菌区系进行研究。从天然冬虫夏草的子座、菌核和菌膜3个部位共分离到572个真菌菌株,并根据形态特征将大部分菌株鉴定到37个不同的属。这些菌株经SSCP(single-strand conformation polymorphism)分析后,再根据nrDNAITS序列的相似性(以97%为阈值)共区分出92种不同的分类单元(operational taxonomic unit,OTU)。其中,属于子囊菌的菌株数及OTU数均比接合菌和担子菌多。从菌膜分离的菌株数及OTU数都明显多于子座和菌核。分离自子座的优势真菌是产黄青霉Penicillium chrysogenum,而分离自菌核和菌膜的优势真菌均为玫红假裸囊菌Pseudogymnoascus roseus。尚未最终鉴定的部分真菌可能为新的真菌物种。     

曲霉和青霉属内杂种和亲株的蛋白质电泳图谱比较

曲霉属内黑曲霉(Aspergitlus niger)与米曲霉(A.oryzae)具有特征明显不同的可溶性蛋白质电泳图谱,其种间杂种具有双亲的部分或全部电泳带并与黑曲霉相近。来自杂种Ⅰ的多数分离子电泳带与黑曲霉相近,只有一个分离子产生米曲霉的电泳带并具有米曲霉的遗传特性。青霉属内产黄青霉(Penicillium chrysogenum)与展青霉(P.patulum)种间及种内不同菌株间的电泳图谱基本相同,种内或种间杂种具有双亲的电泳带。结果讨论了蛋白质图谱分析的意义。     

抗生素和干扰素

950112 由产黄,I『一生产青霉素的生物化学和分子遗传学[会,英2/Martin,J.F.I Ann.N.Y.Acad.s01.-1991,646.-132~201[译自DBA,1992,儿(13),92-07338_'] 将产黄青霉AS-P-78酰基辅酶A;6一氨基青霉烷酸一酰基转移酶纯化至均质并鉴定之。用含粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)PY r4基因和产贝菏霉pyrG基因的质粒载体作选择标记,可获得产黄青霉的高频转化。克隆、表达并测序了产黄青霉AS-P-78的异青霉素-N-合酶基因,还克隆及测序了该菌的酰基辅酶A t 6一氨基青霉烷酸一酰基转移酶和ACV-合成酶基因。产黄青霉DNA的噬菌体EMBL3基因文库…     

根虫瘟霉转寄主过程中毒力相关胞外蛋白酶系的诱导表达

根虫瘟霉Zoophthoraradicans是寄主范围较广的专性昆虫病原真菌。在该菌胞外蛋白酶系与毒力变化关系的研究中,不同寄主来源的根虫瘟霉菌株产胞外蛋白酶水平与其对小菜蛾(Plutellaxylostella)的毒力间无明显的相关性。但转寄主各代菌株随毒力逐步上升产胞外蛋白酶水平也有所增加,两者间有一定的相关性。经活性电泳检测显示,ARSEF1342原始菌株(R0)有分子量分别为148kD,153kD和162kD的三条蛋白酶条带,但转寄主传代菌株(R1~R4)的148kD蛋白酶条带突然消失,而153kD蛋白酶条带则随转寄主传代数增加逐步趋于明显,相关性分析发现153kD和148kD与毒力间具有较好的相关性。这表明根虫瘟霉菌株在转寄主过程中逐渐增加了对新寄主具有较高基质特异性的胞外蛋白酶的诱导表达,从而使转寄主菌株更适应对新寄主的入侵及致病。     

链霉菌S01菌株几丁质醇对植物病原真菌的拮抗作用

纯化后的链霉菌Ｓ０１菌株几丁质酶用环柱法在ＰＤＡ平板上对杨树腐烂病菌、葡萄孢菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐ．ＡＳ３．２６１６）、黄瓜黑腥病菌、辣椒疫病菌、棉花黄萎病菌、立枯丝核菌等植物病原真菌及产黄青霉、啤酒酵母的生长具有明显的抑制作用。在６株植物病原真菌的液体培养物中加入几丁质酶后,菌丝出现扭曲变形、细胞质聚集、外溢等异常现象。在高渗缓冲液中,经几丁质酶处理后,啤酒酵母、葡萄孢菌和产黄青霉的细胞壁受     

产黄青霉菌丝联合及病毒传递

通过营养要求、孢子颜色不同的带病毒和无病毒产黄青霉Penicillium chrysogenum菌株间的菌丝联合,在基本培养基(MM)上获得了营养互补的异核体。异核体菌落上出现亲本类型分离并产生深绿色角变或斑点。经孢子体积,DNA含量及营养类型测定证明角变和斑点为杂合二倍体。经电子显微镜观察,奥氏免疫双扩散,2.4％聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射免疫测定检验了胞质融合或胞质和核融合后代病毒的传递,结果表明黄孢子后代带病毒而杂合二倍体及绿孢子后代均不带病毒。看来,这些绿孢子菌株(821和822)抗病毒感染。     

番茄灰霉病生防融合子基因组DNA提取方法的研究

以番茄灰霉病生防菌株木霉T-23和链霉菌A的融合子为实验材料,在SDS-CrAB法、改进CTAB法和氯化苄法的基础上加以改进,比较和研究了真菌融合子基因组DNA的提取,找到了一种快速、高效的基因组DNA提取方法,为进一步对融合子进行生防机制和分子生物学水平的研究提供基础。结果表明SDS-CTAB法提取的基因组DNA OD_(260)/OD_(280)为1．909,DNA浓度约为42．0ng/μL,可以满足分子生物学实验的需要。并将提取的基因组DNA直接用于PCR扩增,得到了多态性的RAPD图谱。     

潞酒酒窖壁及酒缸上可培养真菌的分离和鉴定

采用察氏培养基对山西省长治市潞酒有限公司地下酒窖墙壁及酒缸外壁上采集的灰黑色霉状物进行分离纯化以获得真菌纯培养物,然后用扫描电镜和乳酸石炭酸棉蓝染色法在显微镜下观察纯培养物的菌丝体,再利用18S rDNA序列、β-tubulin微管蛋白基因(BenA)序列、Calmodulin钙调蛋白基因(CaM)序列分析技术分别对分离的纯培养物进行分子水平的鉴定并构建系统发育树。共分离到3株可培养真菌,分别是LJB-1、LJ3-2和LJ5-2。其中菌株LJB-1鉴定为地窖无孢霉Racodium cellare,该种在国内未见报道,属于国内新记录种;菌株LJ3-2和LJ5-2分别鉴定为小刺青霉Penicillium spinulosum和产黄青霉Penicillium chrysogenum,这两个种在酒窖菌中鲜见报道。     

产毒真菌基因组研究进展

真菌毒素是产毒真菌产生的次生代谢产物,以木霉、曲霉、毛霉、青霉和根霉为主的丝状真菌是农产品中常见的产毒真菌。阐明农产品中产毒致病微生物的基因组序列信息是揭示真菌特殊遗传性状的基础。截至2013年12月,共有子囊菌门中204个种和担子菌门中62个种的基因组序列已经测序或公布,它们的基因组大小大部分在30-40 Mb。整理了部分已完成基因组测序的具有产毒能力或致病力的真菌基因组信息,并对真菌测序方案、主要产毒真菌及其比较基因组学的研究进展进行了综述。     

医药上的应用

抗生素和干扰素952102产黄青霉高产菌株的线性筛选[俄]/Rusill0V,S.F.∥Prikl.Biokhim.Mikrobi01.一1994,30(6).一884～888[:译自DBA,1995,14(2),95—00780] 研究了利用一些特点线性筛选产黄青霉的几种简单方法的效能。筛选出一种新的青霉素高产菌株产黄青霉。该菌具有低的发酵液牯滞性和高的氨解活性,并能在机械能输入1.3kW/cum培养97hr的发酵罐中产生32600U,/m1苯氟基甲基青露素。培养液的高氨解活性和低牯滞性决定了可以用玉米粉进行发酵。 (陶冶)9521 05通过批式添加底物生物合成林可霉素[俄]/Sere e—nova,L.E.…∥Antibiot.Khi…     

非生长产黄青霉吸附铅的研究

本文报道非生长产黄青霉(Penicillium chrysogenum)对溶液中铅离子的吸附。菌体对铅的吸附依赣于溶液的pH值,在pH4-5范围内,其饱和吸附量(116mgPb2+／g干菌)高于活性炭及文献中所报道的蕈状芽抱仟菌(Bacillus mycoidrs),小刺青(Penicillium spinulosum)及长木链霉(Streptomyces longwoodensis)等。当pH4．5时,产黄青霉对铅的选择性高于Zn2+、Cd2+,Cu2+和As3+Cu2+、As3+的存在对铅的吸附无明显影响。Cd2+的存在使铅的吸附量有所提高．而Zn2+的存在则使之降低。在小试规模下,经本法处理过的含铅工业废水,铅含量降至1.0mg／1．以下,达到国家规定的工业废水铅含量的排放标准。     

葡萄孢菌真菌病毒研究进展(综述)

分析寄生于葡萄孢中真菌病毒的种类及其对寄主真菌的影响,描述其中5种病毒的形态及基因组结构,根据葡萄孢真菌病毒的研究现状提出未来研究方向,为葡萄孢真菌病毒的深入研究和利用提供参考。     

寄生蜂携带的多DNA病毒的起源及其特性

病毒在通常意义上都是有害的寄生生物,但是有一类特殊的多DNA病毒(PDV)却成为在数量庞大的寄生蜂的生活史中不可或缺的共生病毒.PDV随着寄生蜂的卵一起被注入到寄主的体内,调控寄主的免疫和发育生理,从而确保幼蜂在寄主体内生存发育.PDV的基因组整合在寄生蜂的基因组内,因此PDV病毒粒子的形成并非在寄主受到侵染的组织内,而是位于寄生蜂卵巢的特定细胞(卵萼细胞)中,其编码的蛋白质几乎没有病毒结构性蛋白,主要的表达产物都用于调控寄主的生理活动.PDV基因编码序列比对分析结果显示,茧蜂病毒(BV)与致病性的裸病毒nudivirus和杆状病毒baculovirus存在一定的亲缘关系,然而这些同源基因已高度分化,具有不同的生物学特性,同时也不能确定这些基因是否还具有原始的功能.在寄生蜂基因组中尚有许多与裸病毒和杆状病毒类似的基因,其中一部分基因能够编码BV病毒粒子的结构蛋白,其表达模式亦与PDV病毒粒子的形成有关.由于PDV使用了与这2种病毒类似的传播途径,才使得寄生蜂的PDV基因转入寄主体内发挥作用,虽然这不能说明PDV属于这2种病毒,至少存在PDV从这2种病毒发展而来的可能性.