天花粉蛋白对体外培养不同种类细胞的作用

本文进行了天花粉蛋白对离体培养的葡萄胎细胞、早孕蜕膜细胞、人胎儿肾皮质部细胞、HeLa细胞和鼻咽癌上皮细胞的损伤作用的比较研究。为了探索天花粉蛋白选择损伤细胞是否存在专一结合细胞的可能性,又以不敏感的蜕膜细胞为材料,应用辣根过氧化物酶标记技术进行了天花粉蛋白与细胞结合和进入细胞内定位的实验。此外,并以肝癌细胞为材料研究了对细胞增殖率的影响。结果表明葡萄胎合体滋胚层细胞和胎盘合体滋胚层细胞一样都是最敏感的细胞,经1微克天花粉蛋白处理即出现形态上损伤,至50微克则大多数细胞呈现不可逆的退化损伤,而其它类型的细胞则表现出有相当大的抗性。过氧化物酶标记追踪天花粉蛋白在细胞内分布的结果表明天花粉蛋白与蜕膜细胞有一定的亲和力,提示天花粉蛋白似乎不存在严格的细胞结合专一性;而天花粉蛋白在细胞内的分布一般仅限于细胞质,这一现象似乎提示细胞质区可能就是天花粉蛋白直接作用的靶的范围。细胞增殖率的实验结果表明50微克以上的药物剂量对肝癌细胞增殖率有一定的抑制作用,剂量增加抑制作用也增加。但是,经过一定的修复期以后,细胞增殖率又可得到完全恢复,反映了对细胞生长抑制的可逆作用。上述实验结果进一步加强了天花粉蛋白对滋胚层细胞具有一定细胞损伤专一性的结论。本文并对细胞损伤专一性问题进行了讨论。     

DEK对人子宫内膜蜕膜化的调节作用

为探讨DNA结合蛋白果蝇Eph激酶(Drosophila Eph kinase,DEK)对人子宫内膜基质蜕膜化的调节作用和途径,该研究采用qPCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction)、免疫组化(immunohistochemical)和蛋白印迹(Western blot)分别检测人子宫内膜增生期、分泌期和蜕膜组织中DEK基因和蛋白的表达;利用siRNA抑制基质细胞和蜕膜细胞的DEK,再用细胞流式技术、细胞免疫荧光、qPCR、细胞碱性磷酸酶脂显色和Western blot检测DEK沉默后细胞的变化。结果显示,蜕膜组织中DEK mRNA表达水平低于增生期和分泌期(P0.05),蜕膜组织中DEK蛋白表达水平高于增生期和分泌期(P0.05);抑制基质细胞DEK会使细胞增殖和分化能力降低,从而抑制基质细胞蜕膜化;抑制蜕膜细胞DEK可使细胞凋亡增加,DNA损伤情况加剧,导致蜕膜细胞的维持和发展受到影响。综上,该研究初步证实,DEK可能通过调控细胞蜕膜化而参与胚胎着床过程,其可能途径与其通过调控细胞增殖、分化、凋亡和核损伤有关。     

睾丸酮对离体培养人蜕膜细胞形态的影响

实验选用早孕人工流产蜕膜组织进行体外培养,观察睾丸酮对蜕膜细胞形态的影响并与RU 486加以比较。研究结果提示:(1)睾丸酮(6.9×10~(-5)mol/L)能抑制离体培养人蜕膜细胞的生长发育,但这种抑制作用是暂时和可恢复的且与用药剂量及持续时间有关。(2)睾丸酮对蜕膜细胞形态的影响与RU 486(4.7×10~(-4)mol/L)的作用效果相似。     

基于小分子化合物库筛选协同多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂杀伤卵巢癌细胞的药物

多腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerase, PARP)抑制剂是一类靶向 DNA 修复缺陷癌细胞的新型药物。早期研究表明 PARP 抑制剂取得了令人满意的结果,然而药物治疗后出现的耐药机制尚未完全揭露。因此,有必要寻找更多的靶向药物与PARP 抑制剂联用,以达到杀伤肿瘤细胞的目的。本文基于379种小分子化合物和PARP抑制剂尼拉帕尼(Niraparib)的联合用药筛选,通过细胞增殖实验、克隆存活实验和免疫荧光染色等方法筛选潜在的具有协同PARP抑制剂杀伤卵巢癌细胞的药物。结果表明,其中有8种小分子化合物具有较好的联合用药效果,包括2种已经报道的与PARP抑制剂具有联用效果的小分子化合物STF-118804和Disulfiram。我们从中选取原肌球蛋白受体激酶 A (tropomyosin receptor kinase A,TrKA)的抑制剂GW441756,进行了多种肿瘤细胞的验证以及初步机制的探究。Niraparib和TrKA抑制剂的联合用药显著增加肿瘤细胞对PARP抑制剂的敏感性(P<0.05)。从机制上分析,联合用药组细胞内γH2AX foci的数目显著增加(P<0.05),说明TrKA抑制剂阻碍损伤后细胞的DNA损伤修复能力;同时,联合用药显著降低细胞内同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)标志物RAD51 foci(P<0.05)的形成,说明TrKA抑制剂可能通过抑制细胞的HRR效率阻碍细胞的DNA损伤修复。本研究的结果提示,TrKA抑制剂可以作为一种与PARP抑制剂联用杀伤卵巢癌细胞的潜在药物。     

子宫自然杀伤细胞在人类早孕蜕膜血管 生成中的作用研究

子宫内膜蜕膜化过程伴随着活跃的血管生成是妊娠时新血管形成的关键步骤. 本研究旨在明确子宫自然杀伤细胞(uNK, CD56⁺细胞)在人类早期妊娠蜕膜组织中的分布, 并观察这类细胞是否表达血管内皮生长因子(VEGF-A)和促血管生成素2(Ang2). 免疫组化研究发现, uNK细胞(CD56⁺)大量存在于子宫蜕膜间质中, 主要集中在血管和腺体周围的间质组织, 蛋白水平的VEGF-A和Ang2表达于蜕膜间质细胞、微血管内皮细胞和腺上皮细胞中, uNK细胞在子宫蜕膜间质中的阳性率与平均微血管密度(MVD)、uNK细胞的阳性率与VEGF-A蛋白阳性表达率呈正相关关系, 而与Ang2无相关性. 另外, 在激光微切获得的单个uNK细胞进行巢式PCR的研究结果显示, 人类蜕膜的uNK细胞能够表达VEGF mRNA, 未测得Ang2 mRNA在单个uNK细胞表达. 表明人类早孕子宫蜕膜中的uNK细胞通过表达VEGF-A, 在蜕膜化过程和胎盘早期形成时的血管生成中发挥重要作用.     

子宫自然杀伤细胞在人类早孕蜕膜血管 生成中的作用研究

子宫内膜蜕膜化过程伴随着活跃的血管生成是妊娠时新血管形成的关键步骤. 本研究旨在明确子宫自然杀伤细胞(uNK, CD56⁺细胞)在人类早期妊娠蜕膜组织中的分布, 并观察这类细胞是否表达血管内皮生长因子(VEGF-A)和促血管生成素2(Ang2). 免疫组化研究发现, uNK细胞(CD56⁺)大量存在于子宫蜕膜间质中, 主要集中在血管和腺体周围的间质组织, 蛋白水平的VEGF-A和Ang2表达于蜕膜间质细胞、微血管内皮细胞和腺上皮细胞中, uNK细胞在子宫蜕膜间质中的阳性率与平均微血管密度(MVD)、uNK细胞的阳性率与VEGF-A蛋白阳性表达率呈正相关关系, 而与Ang2无相关性. 另外, 在激光微切获得的单个uNK细胞进行巢式PCR的研究结果显示, 人类蜕膜的uNK细胞能够表达VEGF mRNA, 未测得Ang2 mRNA在单个uNK细胞表达. 表明人类早孕子宫蜕膜中的uNK细胞通过表达VEGF-A, 在蜕膜化过程和胎盘早期形成时的血管生成中发挥重要作用.     

钙调素拮抗剂与胞内钙离子浓度对离体培养的人蜕膜细胞活力的影响

应用妊娠 6～ 8周的人工流产蜕膜组织为材料进行离体人工蜕膜细胞培养 ,观察两种化学结构完全不同的特异性钙调素拮抗剂——三氟拉嗪、蝙蝠葛碱衍生物 ,以及 Ca2 + 螯合剂—— EGTA和 Ca2 +载体—— A2 3187对蜕膜细胞活力的影响。结果表明 :三氟拉嗪、蝙蝠葛碱衍生物与 EGTA对蜕膜细胞活力的抑制作用与药物的浓度及其作用时间密切相关 ,随着浓度加大及作用时间延长而增强。≥ 1 5 μmol/L的三氟拉嗪或≥ 2 5 μmol/L的蝙蝠葛碱衍生物 ,或2 mmol/L的 EGTA均可明显抑制蜕膜细胞活力。三氟拉嗪和蝙蝠葛碱衍生物作用 96小时后分别使细胞活力降至对照组的 8.7%和 1 2 .0 % ,EGTA作用 72小时后降至对照组的 2 8.6%。6μmol/L的 A2 3187可一定程度地刺激细胞活力上升 ,但这种刺激效应随作用时间的延长而逐渐减弱。EGTA可增强三氟拉嗪对细胞活力的抑制作用。由此推测 ,Ca2 + -钙调素系统可能直接参与子宫蜕膜的发育和维持 ,并在其中发挥重要作用。这可能也是钙调素拮抗剂抗早孕的主要机理之一。     

人早孕子宫蜕膜催乳素分泌的调节

子宫内膜蜕膜化对胚泡植入与妊娠维持是非常重要的。为探讨蜕膜化维持的调节机制 ,本文研究了妊娠早期人子宫蜕膜细胞催乳素 (PRL)分泌的调节。结果表明 :(1)孕酮显著地刺激PRL的分泌。 (2 )雌激素的作用与其浓度有关 ,生理浓度的雌激素对PRL分泌无明显影响 ,而高水平的雌激素抑制孕酮的刺激作用。合适的雌孕激素比例对蜕膜化的维持是必要的。 (3)RU486明显地抑制PRL的分泌 ,故认为孕酮的作用至少是部分通过受体介导的机制。 (4 )高浓度的cAMP (≥ 10 -5mol/L)显著增加PRL的分泌 ,cAMP信号系统可能在蜕膜化反应中发挥重要作用。     

用彗星实验技术分析MTX对小鼠细胞DNA的损伤作用

MTX是一种抗叶酸药物 ,作用于增殖细胞 ,为了解其作用机制和探测其遗传毒性靶器官 ,以小鼠为研究对象 ,用彗星实验技术检测了MTX腹腔注射染毒后对脾、骨髓、胸腺、和外周血淋巴细胞的DNA损伤作用及其与MTX剂量间的相关。 1.2 5～ 5mg/kgMTX可诱发小鼠体内 4种细胞的DNA单链断裂 ,核DNA损伤程度与用药剂量呈正相关。不同种类细胞对MTX的易感性不同 ,脾、骨髓、胸腺、外周血淋巴细胞可能是MTX的遗传毒性靶细胞。外周血淋巴细胞在SCGE分析中的拖尾现象可作为用药后组织器官对药物敏感性反映的生物标志     

神经生长因子对PC12细胞脂多糖损伤的保护作用及其机制

目的：细胞水平研究神经生长因子（NGF）对大鼠嗜铬细胞瘤细胞株（PC12细胞）脂多糖（LPS）损伤后的保护作用以及核转录因子（NF-κB）的活性影响,探讨药物作用机制。方法：PC12细胞常规培养后,建立LPS损伤模型,随后MTT观察不同浓度的LPS对PC12细胞损伤及NGF对LPS损伤的保护作用,同时用倒置显微镜和荧光显微镜下观察细胞状态,最后RT-PCR检测NF-κB的含量。结果：①PC12细胞LPS损伤有浓度梯度,随着LPS浓度的增加,PC12细胞的存活率不断下降;LPS损伤的同时加入不同浓度NGF,LPS损伤均有明显的改善。②显微镜观察显示PC12细胞形态学上的改变,表明NGF对LPS损伤有保护作用。③RT-PCR结果显示,LPS损伤细胞的NF-κB的相对表达量明显高于正常对照细胞,而药物治疗组的NF-κB表达量则接近于正常细胞。结论：目前,神经生长因子在脑内炎症后的细胞修复作用报道甚少,而本实验研究神经生长因子对PC12细胞LPS损伤起到保护作用,尤其是损伤后再修复作用,且其作用机制可能与NF-κB信号通路的调控有关。     

幼龄大鼠子宫内膜蜕膜化的研究

出生10—14天的Wistar大鼠,在雌二醇和孕酮一定剂量和时程的作用下,以油剂作为蜕膜化刺激,成功地诱发了蜕膜瘤。并在亚显微结构水平上,系统地观察了基质细胞转化为蜕膜细胞的过程。结果表明,出生10—14天的幼龄大鼠子宫内膜,已能对卵巢甾体作出迅速反应。孕酮加微量雌激素处理第三天,基质细胞已处于敏感时期,具备了向蜕膜细胞转化的条件,只是在蜕膜化刺激作用后12小时,才实现了这一转化。子宫内膜上皮在子宫腔内注油后开始解体,基膜处积聚大量无定形物质,它在基质细胞蜕膜化中可能起重要作用。     

脑益康药物血清对谷氨酸诱导海马神经元损伤的保护作用

目的:探讨脑益康药物血清对谷氨酸(Glu)诱导的海马神经元损伤的保护作用。方法:大鼠海马神经元培养后,采用形态学观察、MTT法及DAPI染色法检测脑益康药物血清对Glu损伤细胞活力的影响,采用RT-PCR和免疫组化方法检测脑益康药物血清对Glu损伤细胞PTEN表达的影响。结果:脑益康药物血清可明显提高Glu损伤的海马神经元的细胞活力,减少PTEN的表达。结论:脑益康药物血清对Glu诱导的海马神经元损伤有保护作用,其机制可能与减少PTEN表达,抑制神经元凋亡有关。     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因抑制小鼠子宫基质细胞的蜕膜化

为了观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因对体外培养的小鼠蜕膜基质细胞增殖及凋亡的作用,探讨TRAIL对小鼠子宫蜕膜化进程的影响,构建TRAIL过表达及干扰质粒,转染小鼠基质细胞后诱导蜕膜化发生.转染72h后,应用半定量RT-PCR和Western blotting检测蜕膜基质细胞中TRAILmRNA和蛋白质的表达情况、MTT法观察蜕膜基质细胞的生长和增殖能力、流式细胞术检测蜕膜基质细胞的细胞周期分布情况和凋亡率.经酶切和核苷酸测序证实,TRAIL基因正确克隆入真核表达载体且能够上调TRAIL的表达,干扰质粒能有效地抑制TRAIL基因的表达.TRAIL过表达和RNA干扰的结果表明:TRAIL具有将蜕膜基质细胞阻滞在G0/G1期、抑制蜕膜基质细胞增殖并促使其凋亡的功效,提示TRAIL可能参与调节胚胎植入后基质细胞的有序蜕膜化进程.     

原癌基因C-MET在自然流产蜕膜中的表达降低

为探讨原癌基因C-MET在胚胎着床中的作用,本实验分别采用实时荧光定量PCR,原位杂交和免疫荧光化学方法检测C-MET的mRNA及其蛋白在正常妊娠人工流产子宫蜕膜和自然流产蜕膜中的表达情况;进一步采用围着床期小鼠(d3)单侧宫角注射C-MET多克隆抗体,观察胚胎着床变化。结果显示C-MET基因和蛋白在正常妊娠蜕膜组织中的表达量显著高于自然流产蜕膜组织(P0.01),且主要分布在蜕膜基质细胞胞浆和胞核中。围着床期小鼠单侧宫角注射C-MET多克隆抗体后,该侧多个胚胎发生流产。该结果提示原癌基因C-MET可能在胚胎着床过程中发挥了重要作用,其表达降低可能通过某些途径诱发自然流产。     

PCNA 泛素化对Hela 细胞苯并芘损伤敏感性的影响

目的:观察PCNA泛素化修饰对Hela细胞损伤敏感性的影响。方法:Western blot法检测His-PCNA及His-mutant PCNA(mPCNA,K164R)在Hela细胞中的表达。DNA损伤剂苯并芘(BaP)和依托泊苷(VP-16)分别处理Hela细胞后,MTT法检测不同细胞系对DNA损伤药物的敏感性;Western blot法检测细胞PCNA的泛素化修饰。结果:Western blot结果显示His-PCNA和His-mPCNA在Hela细胞中稳定高表达。MTT结果显示,苯并芘损伤后,稳定高表达mPCNA的细胞系与野生型及高表达PCNA细胞系相比,其细胞存活率呈明显下降趋势,而VP-16作用后,三种细胞存活率无明显差异。Western blot结果显示苯并芘损伤可特异性诱导PCNA发生泛素化修饰。结论:苯并芘损伤能够诱导PCNA发生泛素化修饰,从而降低Hela细胞对苯并芘损伤的敏感性。     

5—氨乙酰丙酸与氨乙酰丙酸己酯对肝癌细胞的光动力作用比较

5 氨乙酰丙酸 (ALA)可在肿瘤内诱导原卟啉区 (PpIX)光敏剂形成 ,但其亲脂性极差 ,进入细胞的能力有限。脂化的ALA衍生物能增强其进入细胞的能力 ,增进细胞中PpIX的合成。比较了氨乙酰丙酸己酯 (He ALA)与ALA对肝癌细胞中PpIX的生成及光动力损伤作用。细胞的荧光显微图象显示 ,经He ALA培育后 ,细胞中生成了PpIX。PpIX分布在细胞质中 ;细胞的荧光光谱显示出PpIX的特征荧光峰 ,证实细胞中PpIX的生成。实验发现 ,0 .2mmol/L的He ALA药物浓度与 2mmol/LALA的药物浓度在细胞中生成的PpIX含量相当 ;予以相同剂量的光照射后 ,两者对细胞的光敏损伤程度相近 ,反映He ALA对癌细胞有更高的光动力损伤功效。因此在光动力治疗的应用中 ,He ALA是一种极有开发前景的新药物     

着床期小鼠子宫内膜中EGF及其受体转录和表达状况的研究

为探讨表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF)在胚泡着床过程中的作用。本文应用原位杂交和免疫组织化学方法,检测了EGE及其受体在胚泡着床前后小鼠子宫内膜中的转录和表达。结果显示：未孕和受精后第4-5天,子宫内膜表面上皮和腺上皮细胞仍呈EGF,EGFR原位杂交和免疫组化阴性着色,受精后第4-5天子宫内膜基质细胞EGF及其受体转录和表达较未孕期增强,受精后第6天,EGF及其受体免疫组化和原位杂交阳性着色主要分布于初级蜕膜带（primary decidual zone,PDZ);随着胚泡植入的进行,PDZ区蜕膜细胞EGF及其受体的转录和表达明显减少,而PDZ周围蜕膜细胞EGF及其受体的转录和表达增强,结果提示,EGF是小鼠胚泡着床过程中的一个重要调节因子。     

DNA错配修复与癌症的发生及治疗

DNA错配修复是细胞复制后的一种修复机制,具有维持DNA复制保真度,控制基因变异的作用。DNA错配修复缺陷使整个基因组不稳定,最终会导致肿瘤和癌症的发生。DNA错配修复系统不仅通过矫正在DNA重组和复制过程中产生的碱基错配而保持基因组的稳定,而且通过诱导DNA损伤细胞的凋亡而消除由突变细胞生长形成的癌变。错配修复缺陷细胞的抗药性也引起了癌症化疗研究方面的关注。大多数情况下,错配修复健全型细胞对肿瘤化疗药物敏感,而错配修复缺陷细胞却有较高的抗性。DNA错配修复系统通过修复和诱导细胞凋亡维护基因组稳定的功能,显示了错配修复途径在癌症生物学和分子医学中的重要性。     

二甲双胍联合奥沙利铂抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖和诱导凋亡

探讨体外培养的人胃癌细胞株SGC-7901经由二甲双胍与奥沙利铂联合处理后增殖和凋亡的响应及药物作用机制。采用CCK-8增殖检测法检测药物处理下对细胞的增殖影响并计算出两种药物的IC50值。采用RT-PCR、Western blotting以及流式细胞术检测药物作用下SGC-7901细胞周期相关和凋亡相关蛋白的mRNA水平、蛋白水平和凋亡水平。实验结果显示,二甲双胍和奥沙利铂单独作用都能够抑制SGC-7901细胞的增殖,联合用药组较单独用药组对细胞的抑制率更高。二甲双胍和奥沙利铂单独作用都能够抑制SGC-7901细胞cyclin D1的mRNA和蛋白水平,药物联用后,对细胞cyclin D1的抑制表达效果更明显。与对照组相比较,二甲双胍和奥沙利铂单独作用均能显著诱导SGC-7901细胞发生凋亡(p0.01),联合用药组亡率((50.13±10.75)%)明显高于单独用药的二甲双胍组((35.06±9.17)%)和奥沙利铂组((42.59±11.98)%)。二甲双胍和奥沙利铂单独都能够抑制SGC-7901细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平,并增加促凋亡蛋白Bax以及凋亡执行caspase3的mRNA和蛋白表达水平,而联合用药组中这种调控效果更加显著。二甲双胍与奥沙利铂能够抑制胃癌细胞的增殖并诱导细胞发生凋亡,可能是通过促进Bax和caspase3的表达,抑制cyclin D1和Bcl-2表达来实现的。     

结合肽P201与5-氟尿嘧啶联合用药对肝癌HepG2细胞的协同杀伤作用及抗耐药分子机制

目的:采用多种方法探究FoxM1/mdr1信号调控的结合肽P201与5-氟尿嘧啶(5FU)联合用药对肝癌细胞HepG2的协同杀伤作用及抗耐药分子机制。方法:CCK-8法测定联合用药对HepG2细胞的抑制杀伤作用;吖啶橙/溴化乙锭(AO-EB)荧光双染、AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;细胞划痕和Transwell细胞迁移实验检测HepG2细胞迁移能力;最后通过qRT-PCR和Western印迹检测HepG2细胞中FoxM1、mdr1和ABCG2等耐药相关基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量。结果:联合用药[P201(45.0μg/mL)+5FU(100.0μg/mL)]作用48h抑制率达83.8%,作用24h的抑制率为77.8%,显著高于单独用药(P<0.001);流式细胞术检测联合用药细胞凋亡率达43.4%,而单独用药分别为19.4%、25.1%;联合用药在mRNA水平可显著下调HepG2细胞中的FoxM1、mdr1耐药基因,与蛋白水平结果一致;联合用药可显著抑制HepG2细胞的迁移。结论:联合用药对HepG2细胞有强的抑制杀伤作用,在促进细胞凋亡的同时可显著抑制HepG2细胞迁移,且通过下调FoxM1、mdr1和ABCG2等耐药基因和蛋白的表达,增加HepG2细胞对5FU的敏感性。提示P201可提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,减少抗癌药物的副作用。