重组人pLXSN—CD80逆转录病毒载体的构建及在CHO和PA317细胞中的表达

CD80, a molecule on the antigen presenting cells, provide costimulation signals for T cell activation and play a key role in tumor immune. Based on our previous work of human CD80 full length cDNA cloning, a retrovirus expression vector pLXSN-CD80 was constructed. CD80 expression cells were selected by G418 from pLXSN-CD80 transfected PA317 and CHO cells by calcium phosphate. Expression, distribution and molecular weight (MW) of CD80 were measured by RIA, FACs and western blot. pLXSN-CD80 transfected CHO cells expressed relatively high level of CD80 protein (approximately the same as Raji cells) with an apparent MW of 40 kD. In the presence of G418 or not, pLXSN-CD80 transfected PA317 and CHO cells maintained CD80 expression for five months of passage. The results indicate that our construct is potent for experimental use in gene therapy.     

转TK基因的人结肠癌细胞对多种原药敏感性的研究

构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）的重组逆转录病毒载体ＬＴＫＳＮ,经ＰＡ３１７细胞包装后,感染人结肠癌细胞株ＬｏＶｏ．用Ｇ４１８筛选到稳定表达ＨＳＶ－ＴＫ基因的细胞克隆ＬｏＶｏ／ＬＴＫＳＮ,ＬｏＶｏ／ＬＴＫＳＮ与野生型ＬｏＶｏ细胞相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变,细胞毒试验证明ＬｏＶｏ／ＬＴＫＳＮ对ＧＣＶ的敏感性很高,半杀伤浓度ＩＣ５０为０．５μｍｏｌ／Ｌ,比野生型细胞提     

转TK基因的人结肠癌细胞对多种原药敏感性的研究

构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）的重组逆转录病毒载体LTKSN．经PA317细胞包装后,感染人结肠癌细胞株LoVo．用G418筛选到稳定表达HSV-TK基因的细胞克隆LoVo／LTKSN．LoVo／LTKSN与野生型LoVo细胞相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变．细胞毒试验证明LoVo／LTKSN对GCV的敏感性很高,半杀伤浓度IC50为0.5μmol/L,比野生型细胞提高了4000倍以上．三种不同的原药GCV,ACV和BVDU对LoLo／LTKSN具有效果不等的杀伤作用．BVDU和GCV联合作用效果更好．旁杀伤效果十分明显,低浓度GCV就可以将合10%LoVo／LTKSN的混合细胞中的大部分肿瘤细胞杀死．     

逆转录病毒载体介导MGMT和MDR1基因增强人脐血CD34＋细胞对联合化疗抗性的研究

To explore whether human umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells transduced with human O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) and multidrug resistance gene (MDR1) increase resistance to 1,3-Bis(2-Chloroethy1)-1-Nitrosourea (BCNU) and P-glycoprotein effluxed drugs, the present authors obtained a full length cDNA fragment encoding MGMT from liver tissue of a patient with cholelithiasis by RT-PCR. A bicistronic retroviral vector G1Na-MGMT-IRES-MDR1 cDNA was constructed and transfected the packaging cell lines GP + E86 and PA317 by electric performation method, using the medium containing VCR and BCNU for cloning selection and ping-ponging supernatant infection between ecotropic producer clone and amphotropic producer clone, cord blood CD34+ cells were enriched with a high-gradient magnetic cell sorting system (MACS), and then transfected repeatedly with supernatant of retrovirus containing human MGMT and MDR1cDNA under stimulation of hemapoietic growth factors. PCR, RT-PCR, Southern blot, Northern blot, Western blot, FACS and MTT assay were used to evaluate the transfer and expression of the double genes in cord blood CD34+ cells. The cDNA encoding MGMT was verified by DNA sequencing and the bicistronic retroviral vector was confirmed by restriction endonuclease analysis. The purity of cord blood CD34+ cells was approximately 92% and recover rate was 75%, the highest titer of recombinant amphotropic retrovirus in the supernatant was up to 5.8 x 10(5) cfu/ml. The efficiency of gene transduction was 18% and 20% tested by colony formation and PCR, respectively. No helper virus was found by both nested PCR and rescue assay. The results showed that dual drug resistance genes have been integrated into the genomic DNA of cord blood CD34+ cells and expressed efficiently. The MTT analysis showed a 4.5 to 7.8-fold increase of resistance of transducted cells to BCNU and P-glycoprotein effluxed drug as compared with the nontransduced cells. This study provided a foundation for ameliorating combination chemotherapy toxicity in tumor clinical trial.     

重组人pLXSN-CD80逆转录病毒载体的构建及在CHO和PA317细胞中的表达

CD80是表达于抗原提呈细胞表面的分化抗原,它提供T细胞活化的协同刺激信号,并在抗肿瘤免疫应答中起着重要作用。我们在克隆了CD80全长。cDNA的基础上,将其与逆转录病毒pLXSN表达载体连接,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将其转染PA317和CHO细胞,经G_(418)筛选获得抗G_(418)的PA317和CHO细胞克隆。以RIA,FACs和Westernblot检测CD80分子在PA317和CHO细胞上的表达、分布和分子量,结果显示,pLXSN-CD80转染的CHO细胞可表达较高丰度的CD80分子,其表观分子量为40kD。pLXSN-CD80转染的PA317和CHO细胞经5个月连续传代培养,无论存在G_(418)的选择压力与否,仍然持续表达CD80分子,表明我们构建的pLXSN-CD80表达载体具有应用于试验性治疗的潜能。     

逆转录病毒介导的HSV—tk在肿瘤基治疗中的应用

本实验将HSV－tk基因构建在逆转录病毒载体PLXSNnco上,经PA317包装后,筛选出5x10^5pfu/ml的TK包装细胞。用该细胞培养上清感染体外培养细胞,并用Ganciclovir-GCV处理,可以对增殖的细胞产生细胞毒害作用。细胞增殖速度越快,细胞毒害作用越强。在体内实验中,将TK细胞直接注射到移植瘤中或与瘤组织悬液混合接种同种小鼠,再用GCV治疗,对肿瘤有较强的生长抑制作用。     

细胞因子基因导入人肿瘤细胞的方法及鉴定

从人外周血单核细胞中抽提总ＲＮＡ为模板,分别用５‘含ＥｃｏＲⅠ３含ＢａｍＨＩ限制性酶切位点的细胞因子基因特异引物成含信号肽全长ＩＬ－２,γ－ＩＦＮ及α－ＴＮＦｃＤＮＡ。然后将这些细胞因子ｃＤＮＡ分别重组入含筛选标记基因Ｎｅｏ逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中,采用磷酸钙共沉淀法转染逆转录病毒包装细胞系ＰＡ３１７。分别收集到含ＩＦＮ－γ,ＴＮＦ－α和ＩＬ－２基因的缺陷型逆转录病毒上清及只具空白载体质粒ｐＬＸＳ     

人IL-12重组逆转录病毒载体在HeLa细胞中的表达

目的:包装携带人白细胞介素12(IL-12)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究.方法:携带IL-12的逆转录病毒重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装,G418筛选.在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定.然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa.PCR、RT-PCR方法检测IL-12基因在HeLa中的整合和表达情况.结果:重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现IL-12基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录.结论:成功包装了携带IL-12基因的逆转录病毒,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的基因IL-12在细胞中表达,为今后IL-12基因治疗宫颈癌的研究奠定基础.     

抑制Hedgehog信号通路改变结肠癌细胞基因表达谱

Hedgehog（Hh）信号通路在机体发育和肿瘤发生中发挥着重要作用。在该研究中,Western blot检测三株结肠癌细胞Hedgehog信号通路组分的表达,结果表明三株结肠癌细胞中HT-29细胞Hedgehog信号通路组分较完整。采用MTT和BrdU法检测Hedgehog信号通路膜受体Smo特异性抑制剂环杷明和末端转录因子Gli1/2的特异性抑制剂GANT61对HT-29细胞的影响,提示这两种抑制剂均显著抑制HT-29细胞生存率和细胞增殖率,且GANT61比环杷明更敏感。表达谱芯片检测阻断Hedgehog信号通路后HT-29细胞基因谱的变化,结合生物信息学分析,揭示HT-29细胞经环杷明和GANT61处理后基因表达呈现抑制特征,其差异基因表达主要以下调为主,其中环杷明主要影响细胞内源刺激等,而GANT61主要影响代谢和类固醇合成,并与MAPK信号通路有关联,两者均能影响细胞免疫及凋亡相关通路。这些结果提示,Hh信号通路有可能作为结肠癌的治疗靶点。     

Diversity of Gene Expression in Hepatocellular Carcinoma Cells

Understanding tumor diversity has been a long-lasting and challenging question for researchers in the field of cancer heterogeneity or tumor evolution. Studies have reported that compared to normal cells, there is a higher genetic diversity in tumor cells, while higher genetic diversity is associated with higher progression risks of tumor. We thus hypothesized that tumor diversity also holds true at the gene expression level. To test this hypothesis, we used t-test to compare the means of Simpson's diversity index for gene expression(SDIG) between tumor and non-tumor samples.We found that the mean SDIG in tumor tissues is significantly higher than that in the non-tumor or normal tissues(P 0.05) for most datasets. We also combined microarrays and next-generation sequencing data for validation. This cross-platform and cross-experimental validation greatly increased the reliability of our results.     

Egr-1基因调控序列连接OSM cDNA表达质粒的构建及其在黑色素瘤细胞中的表达

ＯＳＭ是一种对黑色素瘤细胞显示抑制作用的细胞因子．为进行ＯＳＭ针对黑色素瘤的基因－放射治疗研究,构建了小鼠Ｅｇｒ－１基因调控序列引导入ＯＳＭｃＤＮＡ真核表达质粒（ｐＥＯ）,ｐＥＯ质粒转染小鼠Ｂ－１６黑色素瘤细胞,经Ｇ４１８和抗人ＯＳＭ抗体的筛选,获得了稳定表达ＯＳＭ的克隆细胞（ｐＥＯ－１细胞）,ＯＳＭ表达量可达５．９７ｎｇ每１０５细胞天,分子量为３２ｋＤ．ｐＥＯ－１细胞用一定浓度Ｈ２Ｏ２处理后ＯＳＭ表达量可提高６２％,表明ｐＥＯ重组质粒可在氧自由基的刺激作用下增强ＯＳＭ表达     

胸苷激酶基因治疗胃癌的体外实验

将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物丙氧鸟苷（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ, ＧＣＶ）选择性杀死肿瘤细胞．构建了含胸苷激酶与潮霉素磷酸转移酶（ｈｐｈ）融和基因（ＨｙｔＫ）的真核表达载体ＬＸｐｓｐ－ＨｙｔＫ．以脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）为介导,将这种质粒与仅含潮霉素Ｂ基因的质粒ＬＸＳＨ 分别转染胃癌细胞系ＢＧＣ－８２３,用６０ Ｕ／ｍ ｌ潮霉素Ｂ进行筛选,得到了可稳定传代的阳性克隆,分别命名为ＢＧＣ－ＨｙｔＫ 和ＢＧＣ－Ｈｙ．三种细胞的生长曲线无明显差别．用不同浓度的ＧＣＶ 分别作用于ＢＧＣ－ＨｙｔＫ, ＢＧＣ－Ｈｙ 及ＢＧＣ－８２３,０．０２～２００ μｇ／ｍ ｌ 的ＧＣＶ 对ＢＧＣ－ＨｙｔＫ 细胞有明显的杀伤作用（ＩＣ５０＝ ０．０２ μｇ／ｍ ｌ）,而对另外两种细胞几乎无毒性作用（ＩＣ５０＞ ２００μｇ／ｍ ｌ）．２０ μｇ／ｍ ｌＧＣＶ 作用９６ ｈ 后,仅存在２０％ 的ＢＧＣ－ＨｙｔＫ 就可使周围的大部分ＨＳＶ－ｔｋ－ 的肿瘤细胞死亡,说明存在较显著的“旁观者效应”     

CHD5基因RNAi慢病毒载体的构建及其对结直肠癌细胞生物学功能的影响

目的:研究人类肿瘤相关基因CHD5基因miR-shRNA慢病毒对结直肠癌Lovo细胞的影响。方法:利用软件设计对CHD5基因干扰有效的序列,合成靶序列,退火形成双链DNA,酶切后与载体相连接。将重组慢病毒载体pPRIME-TET-GFP-CHD5与慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G,pRSV-Rev,pMDLg-pRRE共转染293FT细胞,将包装重组慢病毒感染人类结直肠癌Lovo细胞。通过荧光定量PCR和Western blot验证CHD5基因在细胞中的表达情况,应用MTT检测CHD5低表达对Lovo细胞增殖的影响。结果:成功构建pPRIME-TET-GFP-CHD5重组质粒,经酶切及序列测定正确,包装的病毒滴度为3.1×106TU/ml。用制备的病毒上清感染Lovo细胞后,荧光定量PCR和Western blot分析结果显示该慢病毒可分别在转录和蛋白质水平上抑制Lovo细胞CHD5基因的表达,并使得Lovo细胞增殖失控。结论:成功构建CHD5慢病毒表达载体,表达的慢病毒可有效的感染Lovo细胞,提高Lovo细胞的增殖能力。     

逆转录病毒载体介导表达伪狂犬病病毒PK基因MDBK细胞系的建立

细胞凋亡 (apoptosis)是机体在生理条件下受刺激后 ,经过多种途径的信号传导导致细胞产生一系列形态和生物化学方面的改变而引起的细胞自我消亡的过程 ,是程序性细胞死亡 (programmedcelldeath ,PCD)的主要机制 ,它对于机体的发育 ,内外环境的平衡等都具有重要的作用[1,2 ] .研究表明 ,许多病毒具有诱导或抑制细胞凋亡的功能 ,但其发生的机理仍然不清 .随着分子生物学研究的深入 ,人们发现病毒的某些基因与细胞凋亡相关 ,其编码的基因产物或因病毒感染诱导细胞表达的蛋白抑制或诱导细胞发生凋亡 .最近研究表明 ,伪狂犬病病毒 (psedorabies…     

人甲状腺髓样癌TT细胞胃动素基因表达的调控(英文)

目的:研究人甲状腺髓样癌TT细胞系中胃动素基因表达调控。方法:通过人甲状腺髓样癌TT细胞体外培养,观察经cAMP,生长激素或甲状腺雌激素诱导后,胃动素表达的改变以及胃动素对TT细胞生长、侵袭和转移的影响。结果:甲状腺髓样癌TT细胞表达胃动素mRNA,胃动素可抑制TT细胞的生长。当胃动素基因沉默后,TT细胞转移和侵袭能力增加。当TT细胞分别经cAMP、胃动素、生长激素或甲状腺刺激素孵育48小时后,胃动素基因转录增加,降钙素基因相关肽与胃动素mRNA比值持续下降。环磷酸腺苷可降低TT细胞增殖和c-myc基因的表达。结论:人甲状腺髓样癌细胞生长活性可能与甲状腺C细胞(低的降钙素基因相关肽与胃动素比率)分化的表型有关。     

人甲状腺髓样癌TT细胞胃动素基因表达的调控

目的:研究人甲状腺髓样癌TT细胞系中胃动素基因表达调控.方法:通过人甲状腺髓样癌TT细胞体外培养,观察经cAMP,生长激素或甲状腺雌激素诱导后,胃动素表达的改变以及胃动素对TT细胞生长、侵袭和转移的影响.结果:甲状腺髓样癌TT细胞表达胃动素mRNA,胃动素可抑制TT细胞的生长.当胃动素基因沉默后,TT细胞转移和侵袭能力增加.当TT细胞分别经cAMP、胃动素、生长激素或甲状腺刺激素孵育48小时后,胃动素基因转录增加,降钙素基因相关肽与胃动素mRNA比值持续下降.环磷酸腺苷可降低TT细胞增殖和c-myc基因的表达.结论:人甲状腺髓样癌细胞生长活性可能与甲状腺C细胞(低的降钙素基因相关肽与胃动素比率)分化的表型有关.     

组织专一性表达自杀基因治疗人结肠癌的研究

构建了以癌胚抗原(CEA)基因启动子控制的HSV-TK和ECCD的表达质粒PCEA-TK和pCEA-CD. 将它们分别与pSV2-neo共转染人结肠癌细胞株LoVo和人宫颈癌细胞株HeLa. G418筛选得到细胞克隆LoVo/CEA-TK、toVo/CEA-CD、HeLa/CEA-TK和HeLa/CEA-CD. 与野生型LoVo细胞相比, LoVo/CEA-TK和LoVo/CEA-CD形态无明显改变, 生长曲线也相似, 但对GCV或5-FC的细胞毒的敏感性分别提高了2000倍或700倍.而HeLa/CEA-TK(或HeLa/CEA-CD)仍对低浓度GCV(或5-FC)不敏感. 以上结果显示了应用组织专一性表达的自杀基因治疗人结肠癌的可能性.