脆性X综合征FMRP缺失对离子通道的异常调控

脆性X综合征(FXS)由脆性X智力低下蛋白FMRP表达降低甚至完全缺失引起,是最常见的遗传性智力缺陷综合征和孤独症谱系障碍的单基因致病因素。FMRP不仅可与离子通道mRNA结合,如电压门控钾通道(Kv3.1和Kv4.2)等,还直接与多个离子通道作用,如钠激活钾通道(Slack)等。FMRP的缺失导致神经元离子通道表达异常和功能失调,在不同的脑区和不同的神经细胞类型中引起特定的离子稳态失衡、膜电位改变和兴奋性失常,导致神经环路过度兴奋。现就FMRP缺失对不同离子通道的异常调控及其研究进展进行综述。     

FXR1P相互作用RNA的研究

目的:本研究利用酵母三杂交系统从人脑海马回cDNA文库中筛选FXR1P的靶RNA,以进一步阐明FXR1基因的功能。方法:将表达FXR1P全长的质粒pYESTrp3/FXR1转化酵母菌株L40ura3/pHybLex/Zeo-MS2,检测毒性和自激活性;应用酵母三杂交技术从人脑海马回pRH3′-cDNA文库中筛选FXR1P的相互作用RNA;分离初步筛选的结果,再次转化含有诱饵质粒的融合菌株L40ura3/pHybLex/Zeo-MS2/pYESTrp3/FXR1,重新验证阳性结果;最后对阳性结果的外源插入片段进行测序和生物信息学分析。结果:酵母三杂交的筛选得到了3个阳性结果,经过测序和同源性分析,其中一个阳性结果中的插入片段为K-ALPHA-1 mRNA的部分序列。结论:K-ALPHA-1 mRNA可能是一种新的FXR1P的靶RNA。     

人Calpain1与心脏结构蛋白的相互作用

为探讨人calpain1与心脏结构蛋白之间的相互作用 ,采用酵母双杂交体系筛选与人calpain1大亚基相互作用的蛋白质 ,通过DNA序列测定及BLAST分析同源性 ,获得了阳性克隆 12 (pACT2 12 ) ,16 (pACT2 16 ) ,2 2 (pACT2 2 2 )和 37(pACT2 37)等 .12和 2 2分别与人心脏α肌动蛋白 (humancardiacmusclealpha actin ,ACTC)有 99%和 10 0 %同源性 .16和 37分别与人心脏的肌球蛋白结合蛋白C(humancardiacmyosin bindingproteinC ,MYBPC3)和人α2 辅肌动蛋白 (humancardiacalpha 2actinin ,ACTN2 )有 10 0 %同源性 .这些阳性克隆均属于心脏中心肌细胞的结构蛋白 ,参与心肌细胞的收缩运动 .为鉴定calpain1大亚基的哪些结构域可能参与这些相互作用 ,阳性克隆再分别与含有人calpain1大亚基结构域Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的诱饵质粒共同转化AH10 9进行酵母双杂交 ,发现pACT2 12(ACTC)和pACT2 16 (MYBPC3)均能与全长人calpain1大亚基的结构域Ⅱ和Ⅲ相互作用 ;pACT2 16(MYBPC3)还能与大亚基的结构域Ⅳ作用 ;而pACT2 37(ACTN)虽能与全长人calpain1大亚基作用 ,却不与其单独的结构域Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ发生作用 .定量分析阳性克隆与人calpain1大亚基作用的强弱的结果显示 ,pACT2 12、16或 37分别与诱饵质粒pGBKT7 CANP共同转化AH10 9后     

脆性X相关蛋白Ⅰ的研究进展

脆性X相关基因I(FXR1)发现于1995年,位于3号染色体3q28。其产物脆性X相关蛋白1(FXR1P)与脆性X智障蛋白1 (FMR1P)、脆性X相关蛋白2(FXR2P)形成一个RNA结合蛋白家族。目前认为这三种蛋白能输送mRNA分子并调控其翻译过程。FXR1的翻译产物(FXR1P)分子中存在两个KH结构域和一个RGG结构域,这两种结构域与FXR1P分子的RNA结合作用有关。FXR1P的表达具有较高的组织特意性,在横纹肌中表达最高。合适的动物模型对于一种蛋白的功能研究具有十分重要的意义,目前,FXR1敲除的各种动物模型如小鼠、斑马鱼、非洲爪蟾的近亲Xenopus tropicalis已经在不同的实验室建立。本文主要介绍了FXR1P的结构特点、功能及其实验动物模型。     

BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用

RHOX5基因是最早发现的小鼠RHOX基因簇(reproductive homeobox on the X chromosome)成员,可特异性地在生殖系统中表达.RHOX5蛋白在胚胎发育、生殖组织的发育、精子的生成和成熟等多个环节发挥作用,但其功能的发挥途径尚不明确.在前期筛选与RHOX5蛋白相互作用的分子中初步获得一个BRPF1的新型转录本BRPF2.进一步构建pGBKT7-BRPF2质粒,酵母双杂交实验确定其与RHOX5蛋白的相互作用,GST-pull down实验确定其在体外的直接结合;PCR扩增BRPF1基因,构建pGBKT7-BRPF1和pGADT7-BRPF1质粒,酵母双杂交实验和GST-pull down实验证明RHOX5蛋白亦可以直接结合BRPF1蛋白.BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用证实暗示了BRPF2极有可能与BRPF1竞争性结合RHOX5蛋白,为三种蛋白功能的研究提供了新的思路.     

应用多聚酶链式反应快速分析FMR-1基因突变

为了建立一种在先天性智力低下患儿中快速分析脆性X综合征智力低下基因1(Fragile X mental retardation gene 1.FMR-1)突变的方法,对先天性智力低下儿童进行脆性X综合征的大面积筛查和诊断,应用复式多聚酶链式反应一次性扩增FMR-1基因的(CGG)n的重复区,分析CGG重复序列的大小,判断FMR-1基因状态(正常、突变前、突变后),对脆性X综合征可疑患儿快速筛查,在113倒不明原因的先天性智力低下患儿中,分析有脆性X综合征携带者(FMR-1基因前突变者)7例(2男5女),脆性X综合征患者(FMR-1基因突变者)5例,应用多聚酶链式反应可以对脆性X综合征可疑患儿进行大面积初筛,确定携带者和患者。     

IQCE mRNA与FXR1P在酵母三杂交体系中的相互作用

脆性X相关基因1编码蛋白FXR1P是一种RNA结合蛋白,其所结合的靶RNA目前所知甚少。本研究应用酵母三杂交技术对本课题组从pRH3-cDNA人脑海马RNA表达文库中筛选到的一种可能与FXR1P存在相互作用的RNA IQCE进行研究,以验证该RNA与FXR1P的相互作用。方法为:提取利用酵母三杂交技术初步筛选得到的酵母阳性克隆的质粒,转化大肠杆菌Top10,利用其质粒不相容性分离插入了目的片段的pRH3′-cDNA质粒,将该质粒转化入含目的基因FXR1的酵母菌株L40-ura3/pHyb lex/Zeo-MS2/pYESTrp3/FXR1,进行一对一的酵母三杂交验证,最后将该片段进行测序。测序结果为IQCE的一段编码序列,而目前尚无研究报导FXR1与IQCE的相互关系。结论:提示FXR1P与IQCE mRNA存在相互作用,IQCE可能是FXR1P发育调控网络组成成员之一。     

环指蛋白RING1与A型核纤层蛋白的细胞内相互作用

环指蛋白RING1能结合DNA并抑制基因的转录.采用酵母双杂交方法从人骨骼肌文库中筛选出了与A型核纤层蛋白(lamin A)结合的RING1蛋白,回复杂交酵母能在缺陷培养基上生长.RING1与绿色荧光蛋白融合载体转染HEK293细胞,激光共聚焦显微观察发现RING1能与带红色荧光蛋白的lamin A蛋白在细胞核周围共定位.免疫共沉淀结果证明RING1与lamin A能够相互作用.结果证明了一个新的lamin A结合蛋白,为揭示lamin A影响基因表达乃至细胞衰老提供了依据.     

CHK1相互作用蛋白的筛选

将CHK1基因克隆入酵母双杂交载体中,转化入酵母菌AH109,将转化有CHK1基因的酵母菌AH109培养并再转化人前列腺cDNA库质粒,检测报告基因的表达情况,筛选与CHK1相互作用的蛋白。共转化子中有4个β-半乳糖苷酶活性分析和α-半乳糖苷酶活性分析结果为阳性的克隆,但测序结果其中有2个克隆为相同序列。本实验筛选到3个与CHK1相互作用的蛋白,此结果为进一步研究与CHK1相互作用的蛋白奠定了基础。     

用酵母双杂交体系确定病毒特异性蛋白与宿主蛋白的相互作用

用B型流行性感冒病毒BM2蛋白开放阅读框架片段,构建酵母双杂交体系中的"饵”载体,明确其在酵母细胞中的表达,排除自身激活作用,并用酵母双杂交法从人cDNA基因库中筛选出与BM2蛋白相互作用的蛋白.结果表明B型流感病毒BM2蛋白与宿主细胞的某一蛋白有相互作用.应用酵母双杂交体系,可以非常有效地从人cDNA基因库中确定与"饵”蛋白相互作用的蛋白基因.     

LIM蛋白KyoT与PcG蛋白的相互作用

KyoT为LIM结构域蛋白 ,可与转录因子RBP J相互作用并抑制RBP J介导的转录激活。为了研究其功能 ,用酵母双杂交法筛选了与KyoT相互作用的蛋白质 ,其中包括同属于PcG (polycombgroup)家族的蛋白质Ring1和hPc2 (humanpolycomb2 )。为进一步验证KyoT2与Ring1和hPc2的相互作用 ,首先在酵母中证实了KyoT2与它们的相互作用并得到阳性结果。然后做GST pulldown实验在体外验证了KyoT2与Ring1和hPc2在体外的相互作用。进而又构建了KyoT2与Ring1和hPc2不同的截短体 ,利用酵母双杂交进一步验证了它们相互作用的区段 ,发现KyoT的LIM结构域与Ring1的全长相互作用 ,与hPc2的C末端和全长相互作用。本研究验证了KyoT2与Ring1和hPc2的相互作用 ,对探讨KyoT的功能以及分析Notch信号途径与PcG家族的关系提供一定的依据。     

腺病毒E1B 55kD癌蛋白与hDaxx的相互作用

为了探讨腺病毒(adenovirus,Ad)E1B 55kD癌蛋白(Ad E1B 55kD)打破hDaxx和PML共定 位细胞核的作用机制,本文利用体内外共免疫沉淀反应研究Ad E1B 55kD与hDaxx的结合反应 ,并通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用及其作用的氨基酸残基序列.结果显示 Ad2 E1B 55kD通过C端58个氨基酸(aa)与hDaxx结合并发生相互作用.Ad12 E1B 5 5kD与hDaxx结合需全序列aa及其构象.共免疫沉淀反应和Western blot结果证实Ad2/5或Ad1 2 E1B 55kD能在体内外与hDaxx直接结合.     

腺病毒E1B 55KD癌蛋白与hDaxx的相互作用

为了探讨腺病毒 (adenovirus,Ad)E1B 5 5kD癌蛋白 (AdE1B 5 5kD)打破hDaxx和PML共定位细胞核的作用机制 ,本文利用体内外共免疫沉淀反应研究AdE1B 5 5kD与hDaxx的结合反应 ,并通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用及其作用的氨基酸残基序列。结果显示 :Ad2E1B 5 5kD通过C端 5 8个氨基酸 (aa)与hDaxx结合并发生相互作用。Ad12E1B 5 5kD与hDaxx结合需全序列aa及其构象。共免疫沉淀反应和Westernblot结果证实Ad2 / 5或Ad12E1B 5 5kD能在体内外与hDaxx直接结合     

与TaFRA蛋白相互作用候选蛋白的筛选

F-box蛋白是E3泛素连接酶SCF复合体的重要亚基, 通过底物蛋白的特异识别发挥功能。TaFRA是在盐胁迫差异表达片段基础上通过RACE方法获得的一个基因, 编码F-box蛋白。文章利用TaFRA基因构建诱饵表达载体, 直接用cDNA+pGAD+pBD共转化酵母双杂交的方法筛选相互作用的候选蛋白。通过对阳性克隆的鉴定和测序分析, 共获得44个与TaFRA相互作用的候选蛋白, 其中32个为已知蛋白, 包括硫氧还蛋白、金属硫蛋白、ATP合成酶及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等多种逆境胁迫反应蛋白及转录因子蛋白, 说明TaFRA与胁迫反应相关, 可能通过对上述蛋白编码基因的调控参与了植物的胁迫反应过程, 为进一步阐明TaFRA的功能及作用机制奠定了理论基础。     

.用酵母双杂交系统筛选CENP-E相互作用蛋白

纺锤体检验点(spindle checkpoint)是一个重要的细胞分裂生化调节通路, 可监督染色体正确分离和传代．着丝粒相关蛋白E (centromere-associated protein E, CENP-E)是一个分子量为312 kD的微管马达驱动蛋白,可以衔接纺锤体微管与动点并参与纺锤体检验点调控．为研究CENP-E的作用机理,以其动点结合区域为诱饵蛋白,用酵母双杂交技术从人HeLa细胞 cDNA 文库中筛选出了Nuf2蛋白．体外的pull-down实验和体内的免疫共沉淀实验表明, Nuf2蛋白通过其卷曲螺旋(coiled-coil) 功能域特异结合CENP-E的 C 末端区域,间接免疫荧光显示Nuf2与CENP-E共定位于细胞有丝分裂期染色体的动点．由此推论, CENP-E 通过Nuf2的直接作用参与构筑动点-微管界面,进而参与细胞有丝分裂纺锤体检验点信号转导通路,为染色体正确分离发挥调控作用．     

FXR1基因与增强型绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的:构建携带人脆性X相关基因1(Fragile X related gene 1,FXR1)与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent pro-tein,EGFP)的融合表达载体并进行表达,为研究FXR1基因在脆性X综合征中的作用机制奠定基础.方法:以重组质粒pYESTrp3/FXR1为模板,PCR扩增FXR1基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP-N1/FXR1,并用脂质体法转染人胚肾细胞,荧光显微镜下观察GFP在细胞内的表达及Western Blotting检测FXR1的表达情况.结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/FXR1,在人胚肾细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP/FXR1.结论:本实验成功构建EFGP和FXR1重组共表达载体并可在真核细胞中表达,为进一步研究FXR1在脆性X综合征中的作用机理奠定基础.     

人SBK1 cDNA的克隆及其相互作用蛋白的筛选

首次克隆到人的SBK1（homo sapiens SH3-binding domain kinase 1,SBK1）的cDNA序列,并通过生物信息学的手段,电子克隆到人SBK1的基因组DNA序列.人的SBK1是鼠SBK1的直系同源物,两者基因组DNA结构相似,均含有4个外显子.人的sbk1基因ORF长1 275 bp,编码424个氨基酸,而鼠的ORF长1 254 bp,编码417个氨基酸.两者编码区的核苷酸序列同源性达87.7%,而氨基酸序列同源性达95.7%,在羧基端均有一个PV富集区,推测其能与含有SH3结构域的蛋白质结合.将RT－PCR所获得的长度为1 610 bp的sbk1cDNA序列搜索EST数据库,进行电子延伸,最终获得了约5 kb的人sbk1全长mRNA序列,它与鼠的sbk1全长mRNA大小一致;通过比较基因组学发现UniGene族Hs.97837实际上代表了sbk1基因UniGene族Hs.460471的3′UTR区域,而不是代表了一个新的UniGene族.采用酵母双杂交技术,以SBK1为“诱饵”,获得了与之相互结合的蛋白表皮生长因子受体EGFR和核孤儿受体蛋白NR4A1,它们之间的具体功能关系有待进一步研究.     

L1CAM胞内区相互作用蛋白的筛选与鉴定

L1细胞粘附分子(L1cell adhesion molecular,L1CAM)属于神经细胞粘附分子,是属于免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白.L1主要在神经系统中表达,参与神经系统发育,学习记忆等重要过程作用.L1的胞内区可能参与信号转导,对于L1的功能非常重要,为探讨L1胞内区信号转导的分子机制,以L1胞内区为诱饵运用酵母双杂交技术在人脑cDNA文库中筛选其结合蛋白,挑选阳性克隆,进行DNA序列分析和同源检索,阳性克隆编码几个不同的蛋白质,其中一个候选蛋白为PAX6转录因子.为进一步验证L1胞内区和PAX6的相互作用,克隆其基因到表达质粒共转染COS-7细胞,免疫共沉淀证实了L1胞内区和PAX6的相互作用,提示L1胞内区可能参与转录调节,为深入探讨其功能提供了重要线索.     

HeLa细胞中与组织型转谷氨酰胺酶相互作用蛋白质的筛选

组织型转谷氨酰胺酶 (tissuetransglutaminase ,tTG ,TGII)是转谷氨酰胺酶家族成员之一 ,多数细胞凋亡过程中均有tTG表达水平的升高。为研究tTG在细胞凋亡过程中发挥作用的机制 ,利用Gal 4酵母双杂交系统筛选了HeLa细胞中与tTG相互作用的蛋白质 ,获得了 17个阳性酵母克隆。序列测定显示其中 1个克隆所含cDNA序列编码TIA 1相关蛋白 (TIA 1 relatedprotein ,TIAR )C端 12 9个氨基酸残基序列 ,GST下拉 (pull down)实验也证实tTG与TIAR能相互作用 ,而且这种相互作用需要Ca2 参与作用。这些结果提示tTG可能通过其Ca2 依赖的转谷氨酰胺活性对TIAR进行修饰从而影响TIAR的功能 ,可能在细胞凋亡中发挥着一定的作用。