氧对固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu 62固氮酶活性的调节作用

本文研究了在好气条件下,在以谷氨酸为氮源的液体培养基中,固氮螺菌(Azospirllumbrasilense)Yu62固氮酶形成的条件及溶氧压对固氮酶活性的影响。厌氧使整体细胞固氮酶迅速失活;而见氧后固氮酶又重新恢复活性。Western blotting实验证实,这种可逆失活的分子基础,是由于固氮酶铁蛋白-亚基被修饰和去修饰。呼吸抑制剂KCN对固氮酶活性的抑制,亦是由于固氮酶铁蛋白被修饰。因此推论细胞内的能量状态可能是启动固氮酶活化酶系统的重要信号。谷氨酰胺合成酶的抑制剂MSX不能去除厌氧和KCN引起的抑制作用。结果表明：固氮酶活性的NH+4和厌氧关闭可能通过不同的机制起作用。     

蓝藻固氮酶钼铁蛋白的研究

改进了蓝藻固氮酶的分离、提纯方法。首次用小型厌氧聚丙烯酰胺凝胶制备电泳法,代替常用的层析法,获取了电泳纯的蓝藻固氮酶钼铁蛋白,简化了程序,缩短了实验周期。SDS凝胶电泳和分子筛凝胶过滤测定分子量结果表明,钼铁蛋白分子量为360,000,由4个分子量为90,000的同一类型亚单位构成。每个钼铁蛋白分子含1个钼,18个铁和3290个氨基酸残基。其中酸性氨基酸占优势。研究了柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)固氮酶粗提物和钼铁蛋白的某些特性,其结果是:米氏常数为3.33×10~(-3)大气压乙炔,等电点为5—5.5。紫外、可见光谱与其它固氮生物的类似。盐对蓝藻固氮酶较之对其它固氮生物的固氮酶有更大的抑制作用。     

固氮酶

指固氮生物中对固定空气中分子氮并将其转变成氨起特殊催化功能的酶蛋白质。已从16种不同类型固氮生物中分离到固氮酶,它可分为两种独立的酶蛋白:(1)含钼和铁,称钼铁蛋白;(2)含铁,称铁蛋白。一般认为前者是络合和还原氮的中心,后者是电子活化中心。两者单独存在时不能固氮,只有合起来才能重组固氮活性。固氮酶(尤其是铁蛋白)对氧和摄氏零度左右的低温很敏感,易于失活。由于两种蛋白重组固氮活性时的确切比例尚不清楚,加上它们的均一制剂又未得到,所以对整个固氮酶的分子量还无法判断。目     

一种纯化棕色固氮菌固氮酶蛋白组分的方法

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白结晶和铁蛋白的纯化国内外虽已有过一系列报导。但是目前仍有些实验室致力于获得高活性和高产率的固氮酶蛋白研究。我们参考Burgess和Mckenna等人的方法,结合我们的具体情况加以修改,在厌氧条件,产率等方面都取得了较为满意的结果,报导如下。     

固氮螺菌中固氮酶活性的厌氧关闭与细胞内ATP／ADP比值的关系

本文研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)“玉-62”在以谷氨酸为氮源的好气液体培养条件下固氮酶活性厌氧关闭的机制。ATP 合成的解偶联剂 CCCP 使固氮酶迅速失活,Western blotting 实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白—亚基被修饰。用萤光素-萤光素酶法测定表明厌氧处理使细胞内 ATP/ADP 比值迅速下降,固氮酶活性亦迅速被抑制,重新供氧后细胞内 ATP/ADP 比值很快恢复到原水平,固氮酶活性亦迅速上升。CCCP处理亦使细胞内 ATP/ADP 比值迅速下降。低电位电子受体 Metronidazole 制固氮活性,但固氮酶铁蛋白不被修饰,细胞内 ATP/ADP 比值略上升。实验证明,细胞内 ATP/ADP 比值的变化是启动固氮酶铁蛋白修饰系统的信号分子。     

鱼腥藻(Anabaena)对氧敏感的固氮突变种

用紫外线和亚硝基胍,诱变筛选出两株具异形胞而不能在空气中固定分子氮的鱼腥藻Anabaena)突变种。突变表型是稳定的。在微氧条件下,能固定分子氮而生长,但固氮酶活很弱。酶活的高低与藻蓝素含量和光照强度成反相关。突变种细胞的固氮酶对氧非常敏感,反应气相中加入1%的氧对乙炔还原活力已有明显抑制,20%的氧完全阻抑固氮作用。除去氧后固氮酶重新合成,其过程受 NH_4~+和氯霉素阻遏。通过氮饥饿使藻蓝素含量降低,或降低光照强度,或加入二氯苯基甲基脲抑制光合放氧时,均可显著地提高突变种的固氮酶活力。突变种细胞还原氯代三苯四氮唑为甲(?)结晶的能力低于野生种。暗示突变种固氮对氧敏感,可能是由于细胞中清除氧的酶系统有缺损,以致营养细胞产生的活性氧对其本身固氮过程有抑制作用。     

棕色固氮菌钼铁蛋白结晶及一些物理化学性质

获得了棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的针状结晶,大小为2-2.5×25-65微米,成晶所要求的条件不是很严格的。SDS 电泳和氨基酸分析结果表明,钼铁蛋白分子量为250,000。只观察到一种类型亚单位。其中酸性氨基酸占优势。分子氧使针状晶体演变为发状晶丝,晶丝又密集成束。晶束可保存较长时间。氧使钼铁蛋白在电泳时形成高聚合态。       

铁钼辅因子激活氧钝化钼铁蛋白的初步研究

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白氧钝化后,未断裂出任何含钼、铁原子的断片。用有机溶剂从钼铁蛋白中提取得到的铁钼辅因子(FeMoCo)可以激活被氧钝化了的钼铁蛋白,使其还原乙炔能力得到部分或完全恢复。这种激活作用的效率随着钼铁蛋白氧钝化程度的加深而降低。初步结果表明,氧钝化的钼铁蛋白中最先受到损伤的可能是 FeMoCo。如果氧钝化程度进一步加剧,其它部分也可能受到损伤。     

固氮酶内部结构揭秘

固氮酶由钼铁蛋白和铁蛋白组成 ,钼铁蛋白包含ＦｅＭｏｃｏ和Ｐ Ｃｌｕｓｔｅｒ。为解释固氮机理 ,Ｋｉｍ等 ( 1 992 )、Ｐｅｔｅｒｓ等 ( 1 997)和Ｍａｙｅｒ等 ( 1 999)分别解析出分辨率为 2 8 、2 .0 和1 .6 的钼铁蛋白晶体结构。Ｅｉｎｓｌｅ等 ( 2 0 0 2 )又获得了 1 .1 6 的钼铁蛋白结晶 ,在对其进行结构解析后发现 :ＦｅＭｏｃｏ的内部有一个轻的原子与六个铁原子键连接。此轻原子不可能是硫 ,最可能是氮 ,但不排除是碳或氧的可能。已有极好的证据表明ＦｅＭｏｃｏ是固氮酶的底物结合位点和还原中心 ,但底物是如何结合到ＦｅＭｏｃ…     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白特性的研究(三)

应用亚铁螯合剂研究了棕色固氮菌固氮酶铁蛋白中Fe_4S4_簇与Mg·ATP的关系。未变性铁蛋白与螯合剂无反应。Mg·ATP和PCMB促进铁蛋白中的铁与螯合剂的反应。Mg·ADP抑制Mg·ATP的作用。加入Mg·ATP或PCMB后1小时内有75％以上的铁被螯合,20小时内几乎全部被螯合(97％以上)。单独的ATP,ADP,Mg~( )无作用。氧钝化铁蛋白中铁能直接与螯合剂反应,Mg·ATP或PCMB浓度与反应速度的关系符合S型动力学。用Hill作图法得到斜率的为2,说明在铁被螯合前Fe_4S_4簇上(或附近)的两个位置已参与反应。Brdicka反应和羟甲基化作用结果表明钼铁蛋白与铁蛋白巯基二者的相互作用。     

铁钼辅因子

某些固氮生物(如棕色固氮菌)的变种,它们的固氮酶中铁蛋白有催化活性,但由于钼铁蛋白处于不活化状态,所以整个固氮酶不能显示出固氮活性,这种不能固氮的固氮酶可为从野生型固氮菌固氮酶钼铁蛋白中分离得到的物质(或因子)所活化或恢复固氮活性,此种活化因子叫钼铁辅因子。这种钼铁辅因子已从多种固氮生物中分离到,其分子量为1000～3000左右。按钼铁蛋白分子量为270,000计算,其中铝、铁、硫三种原     

固氮酶的研究进展

固氮酶将N2还原为NH3的过程是自然界实现氮循环的重要环节。固氮酶是由γ2型二聚体组成的Fe蛋白和α2β2异四聚体组成的MoFe蛋白组成。固氮酶催化的机制包括铁蛋白的氧还循环和钼铁蛋白的氧还循环两部分。Klebsiella pneumoniae的nif基因簇由20个基因组成,构成了8个转录单位,总长度24206bp,其操控机制是多水平、多层次的调控过程。同时综述了固氮酶的多样性,目前已经发现的有钼铁固氮酶、钒铁固氮酶、铁铁固氮酶以及在Strpomyces thermoauophicus内存在的与已知的三种固氮酶体系明显不同的固氮体系。     

固氮螺菌(Azospirillum.brasilenseYu-62)中固氮酶活性的氨关闭现象

固氮螺菌(A.brasilense)Yu-62在以谷氨酸为氮源好气液体培养条件下,氨离子使固氮酶迅速失活,Western blotting实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加NH_4~ 后细胞内α-ketoglutarte和glutamine的含量.α-ketoglutarate/glutamine比值在加NH_4~ 后瞬间下降然后上升,而细胞内ATP/ADP的比值没有明显变化.谷氨酸合成酶的抑制剂azaserine使固氮酶失活.Western blotting实验表明这种失活的分子基础也是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加azaserine后细胞内α-ketoglutarate及glutamine比值的变化以及外源α-ketoglutarate及glutamine对细胞固氮活性的影响,表明细胞内一些小分子化合物的变化可能是作用于固氮酶活性氨关闭的重要因素.     

固氮螺菌(Azospirillum.brasilenseYu-62)中固氮酶活性的氨关闭现象

固氮螺菌(A.brasilense)Yu-62在以谷氨酸为氮源好气液体培养条件下,氨离子使固氮酶迅速失活,Western blotting实验证明这种失活的分子基础是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加NH_4^+后细胞内α-ketoglutarte和glutamine的含量.α-ketoglutarate/glutamine比值在加NH_4^+后瞬间下降然后上升,而细胞内ATP/ADP的比值没有明显变化.谷氨酸合成酶的抑制剂azaserine使固氮酶失活.Western blotting实验表明这种失活的分子基础也是固氮酶铁蛋白一亚基被修饰.测定加azaserine后细胞内α-ketoglutarate及glutamine比值的变化以及外源α-ketoglutarate及glutamine对细胞固氮活性的影响,表明细胞内一些小分子化合物的变化可能是作用于固氮酶活性氨关闭的重要因素.     

固氮作用

本综述总结了固氮酶的一些物理化学性质。考察了该酶的催化特性,包括固氮酶的电子分配和体内固氮酶的能量要求。主要综述了电子向固氮酶转运的生物能学,包括电子载体和产生还原电势的机制。描述了固氮生物中的铁氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原系统,包括专性厌氧固氮菌、     

钼铁蛋白铁钼辅因子的有机组分对其功能的影响

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶的钼铁蛋白经邻菲啰啉在厌氧或有氧环境中处理后,变为 P-cluster 单一缺失或 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的失活钼铁蛋白。含柠檬酸盐或高柠檬酸盐的重组液都使这两种失活蛋白能恢复固氮酶重组的 H~ 和 C_2H_2还原活性,活性恢复程度随反映钼铁蛋白中金属原子簇含量变化的圆二色和磁圆二色谱及金属含量的恢复程度的提高而提高,但它们固 N_2能力的恢复程度则不相同:P-cluster 单一缺失的蛋白用两种重组液重组后均可恢复其固 N_2能力,而 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的蛋白,只有用含高柠檬酸盐的重组液重组才恢复其固 N_2能力,表明含不同有机组分的重组液所组装的 P-cluster 均与天然状态相同,只有含高柠檬酸盐的重组液所组装的 FeMoco 才与天然状态相同,从而证明高柠檬酸盐是 FeMoco 的必需的有机组分。     

钼,铁,硫化合物激活曝氧的棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的研究

曝氧后,棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白的催化活性和圆二色信号都显著降低,而吸收光谱则显著增加。与钼、铁、硫化合物和二硫苏糖醇组成的重组溶液保温后,曝氢蛋白的圆二色信号和吸收光谱几乎完全恢复至天然状态的同时,乙炔还原活性也得到了显著的恢复,表明重组溶液可使曝氧蛋白中的 P-cluster和其它活性部位都得到了不同程度的修复。     

大豆根瘤菌固氮酶的铁蛋白基因

大豆根瘤菌(Rhizobivmjaponicum)的固氮酶具有与肺炎克氏杆菌(Klebsiella Pneumoniae)和苜蓿根瘤菌(R.meliloti)二者固氮酶相同的铁蛋白基因(nif H)。铁蛋白基因的大小为12.1Kb,部分基因片段已经克隆化。将nifH的一部分克隆化,并使之在大肠杆菌(E.Coli)     

不同底物与固氮酶及其钼铁蛋白相互作用的荧光光谱分析

 本文研究了不同底物(N_2,H_2,N_2O,NaN_3,C_2H_2)对棕色固氮菌固氮酶及其钼铁蛋白荧光光谱的影响。结果表明,上述底物均能络合在钼铁蛋白及固氮酶上,但络合程度不同,从而为固氮酶系统有多个不同的底物络合中心,底物络合中心在钼铁蛋白分子上,铁蛋白对钼铁蛋白有变构作用,提供了光谱学证据。     

简便厌氧透析装置

在一些对氧较敏感的酶(例如氢酶、固氮酶等)的分离纯化过程中,往往要采用硫酸铵分级沉淀除去杂蛋白,然后通过离子交换柱层析和凝胶过滤等方法,获得较均一的样品,进而研究它们的结构和