铁皮石斛种子的室内共生萌发

由于人为的采挖和原生境的破坏,使得铁皮石斛野生资源已濒临灭绝。因此,保护铁皮石斛野生资源及其生境,加快其野生资源的繁殖显得非常重要。以铁皮石斛种子(TTC染色显示种子生活力为77.65%)为材料,与分离自2种野生兰科植物根部的4株共生真菌 (C20来自铁皮石斛,L12,L24b 和 L28来自美花石斛)在燕麦培养基上进行共生萌发。经过18周的共生培养,4株真菌均不同程度地促进了铁皮石斛种子的萌发,其中菌株L24b (Epulorhiza)和L28 (Epulorhiza)显著提高了种子的萌发率,分别比对照高出26.51%和12.20%,但未形成幼苗,只是处于原生分生组织阶段(阶段3);菌株C20(Epulorhiza)和L12 (Alternaria) 虽没有显著提高种子的萌发率,但对原球茎的发育和幼苗的生长有明显的促进作用;而对照的种子仍然处于膨大转绿期,即萌发阶段(阶段2)。同时发现,TTC染色显示的铁皮石斛种子生活力要高于种子共生萌发的萌发率(除了菌株L24b)。研究结果表明:种子生活力染色检测的活力值只代表种子所具有的潜在的萌发能力,而不能代表实际的萌发率。在异地条件下,铁皮石斛与共生真菌间没有严格的专一性,可以与瘤菌根菌属、链格孢属真菌形成共生关系。菌株C20和L12能促进萌发后的种子进一步分化成幼苗。这两个菌株为铁皮石斛的人工优质栽培和野外种群的建立提供了可能。     

四种添加物对铁皮石斛原球茎生长及多糖含量的影响

为探讨铁皮石斛(Dendrobium officinale)培养基中添加物的作用,在1/2MS培养基中加入椰肉、甘蔗渣、香蕉皮和麦麸等4种添加物,研究不同浓度添加物和培养时间对原球茎生长和多糖含量的影响。结果表明,4种添加物对铁皮石斛原球茎的增殖、分化和多糖含量均有一定影响,其中添加15.0 g L–1甘蔗渣,培养60 d能明显促进铁皮石斛原球茎的增殖与分化(146.1%);而添加20.0 g L–1甘蔗渣,培养40 d能显著提高铁皮石斛原球茎多糖含量(50.4%)。这说明甘蔗渣是培养铁皮石斛原球茎的适宜添加物,既能促进铁皮石斛原球茎的生长发育,还能降低生产成本。     

铁皮石斛原球茎常温保存研究

以铁皮石斛原球茎为材料,通过不同培养基、蔗糖浓度、继代周期、保存时间等多种因素对原球茎在保存过程中增殖生长和分化成苗的影响,进行铁皮石斛原球茎常温保存的研究。结果表明:铁皮石斛原球茎常温((25±2)℃)保存的适宜培养基为1/2MS、蔗糖浓度为1%,继代周期可达10个月;原球茎在5年内能保持分化和增值能力,随着保存年限的增加,分化率越来越低,可通过复壮和成苗培养提高分化成苗率。     

真菌对铁皮石斛原球茎酶活性和胞外pH的影响

小菇属真菌制成诱导子处理铁皮石斛的原球茎,引起原球茎胞外pH分两个阶段升高,不同方法制作的诱导子对胞外pH的影响不同。诱导子还诱导原球茎苯丙氨酸解胺酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和脂氧合酶(LOX)活性的升高。PAL和POD活性伴随着胞外pH的升高,也呈现两次升高的特点。经过诱导子两次处理的原球茎的PAL活性升高尤其明显。     

铁皮石斛组织培养及试管苗营养器官和原球茎的结构观察

以铁皮石斛的茎尖为外植体,诱导产生原球茎,进一步培养形成幼苗.结果表明:原球茎诱导以1/2 M S+6-BA 0.3 m g.L-1+KT 0.1 m g.L-1+LH 1.0 g.L-1为最优,而生根培养以M S+NAA 0.05 m g.L-1+KT0.1 m g.L-1+叶酸2.0 m g.L-1+L a稀土10 m g.L-1为佳.对铁皮石斛试管苗营养器官及原球茎的解剖学研究表明,根由复表皮、皮层和维管柱组成,皮层发达,初生木质部五原型,中央具髓;茎由表皮、基本组织和散生维管束构成;叶为等面叶,在上下表皮处分布有厚壁组织;原球茎是由顶端分生组织后面的薄壁细胞脱分化形成胚性细胞经球状胚发育而来.     

铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1对氧自由基和脂质过氧化的影响

铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1的体外抗氧活性研究表明,铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1能明显抑制.OH和O2.-,并呈现良好的量效关系,其IC50分别为1.181和0.727mg/mL;多糖DCPP1a-1可降低体外温育和Fe2 、H2O2诱导的小鼠肝组织匀浆MDA的产生,能抑制小鼠肝线粒体MDA的生成;在1和2mg/mL浓度下能减轻线粒体的肿胀程度,显示出一定的量效关系。表明原球茎多糖DCPP1a-1具有较强的抗氧化活性。也初步显示出离体培养的铁皮石斛可能为石斛多糖的开发提供新的药源。     

低温和外源NO对铁皮石斛原球茎多糖合成的影响

以铁皮石斛(Dendrobium officinale)原球茎为材料,研究了低温(4℃)、外源NO(NO供体SNP)以及NO清除剂(cPTIO)和一氧化氮合酶抑制剂(PBITU)对铁皮石斛原球茎中NO含量、蔗糖合成酶(SS)活性、多糖含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖等糖含量的影响,以明确低温和內源NO在多糖合成中的关系。结果显示:(1)4℃低温处理下,铁皮石斛原球茎中NO含量显著上升,SS活性升高,蔗糖、果糖和葡萄糖含量增加,多糖含量也得到提高;SNP(0.5mmol·L-1)处理与4℃低温处理具有相似的效果;且低温诱导的铁皮石斛原球茎中SS活性提高和多糖含量的增加时期均在NO大量产生之后、蔗糖的积累早于果糖和葡萄糖。(2)4℃低温+SNP组合处理能够显著提高铁皮石斛原球茎中SS活性、NO含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖和多糖含量,它们分别比对照组显著高出了68.04%,96.20%,60.69%、45.64%、66.90%和67.03%,且比低温和SNP单独处理效果都好。(3)PBITU能够部分抑制低温诱发铁皮石斛原球茎中产生NO,抑制率达到77.15%;同时还抑制了低温对铁皮石斛原球茎中SS活性、多糖合成和蔗糖、果糖、葡萄糖积累的促进作用。(4)SNP+cPTIO和4℃+cPTIO处理组中铁皮石斛原球茎SS活性和蔗糖、果糖、葡萄糖、多糖含量及NO水平,且与对照组差异不显著。研究表明,低温和外源NO对铁皮石斛原球茎多糖的合成均具有促进作用,并且低温可诱导铁皮石斛原球茎产生NO,SS活性提高和多糖含量增加与NO产生相关,说明NO是诱导铁皮石斛原球茎多糖合成所必需的信号分子。     

液体悬浮培养促进铁皮石斛原球茎高效诱导、增殖的研究

用正交设计方法对铁皮石斛原球茎具有高效增殖影响的激素（BA,NAA,KT,马铃薯汁）以及配比进行研究,结果表明：以茎段为外植体在培养基Ms＋BA2．0mg／L＋NAA2．0mg／L＋马铃薯汁10％＋糖3％,具有很好的原球茎诱导作用,50d后诱导率达95．20％;原球茎在1／2MS＋BA2．0mg／L＋NAA1．0mg／L＋KT0．5mg／L＋糖3％的培养基上,以液体悬浮培养,原球茎增殖达49．032g／50d。     

授粉方式对铁皮石斛种质座果及种子萌发的影响

为进行铁皮石斛(Dendrobium officinale)的良种选育和种苗生产,对46个铁皮石斛种质进行人工授粉试验,研究了不同授粉方式的授粉成功率、座果率和种子的萌发能力。结果表明,4种授粉方式的授粉成功率明显不同,不同种质间的授粉成功率可达100%,且座果率普遍较高。只有31.3%的种质可以成功自花授粉,且座果率相差较大。同株异花授粉和种质内异株授粉的成功率和座果率均介于上述二者之间。授粉后所得种子的萌发率和萌发速度在4种授粉方式间也呈现与授粉成功率和座果率一致的趋势。这表明在铁皮石斛种质中存在自交不亲和现象,因此以不同产地来源的铁皮石斛种质为亲本进行人工授粉,可大大提高授粉的成功率和座果率,以及后代种子的萌发能力。     

印度梨形孢促进蒺藜苜蓿生长及其提高耐盐性研究

【目的】研究盐胁迫下印度梨形孢定殖对豆科模式植物蒺藜苜蓿生长发育的影响。【方法】通过分析不同生境下植物的根长、根鲜重和茎鲜重,以及体内抗氧化物酶活性、脯氨酸含量、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)的表达,确定印度梨形孢对蒺藜苜蓿生长的促进作用,并初步阐释印度梨形孢诱导植物耐盐性的机制。【结果】印度梨形孢能在蒺藜苜蓿根部定殖并能促进植物的生长发育,有效缓解盐胁迫造成的生长抑制。印度梨形孢能提高植物体内抗氧化物酶活性,增加游离脯氨酸含量并诱导BADH基因的表达。【结论】印度梨形孢作为植物生长促进因子可以用来提高植物耐盐性,实现盐碱土壤的间接改良。     

内生真菌印度梨形孢诱导小麦抗根腐病作用研究

【目的】明确印度梨形孢(Piriformospora indica)诱导小麦对根腐病产生抗性的作用机制。【方法】用印度梨形孢悬液浸种,以无菌培养液为对照,用病原菌禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)侵染小麦,对其相关生理生化指标及转录组变化进行分析。【结果】禾谷镰孢菌能诱导小麦产生过氧化氢,降低细胞内水含量,破坏细胞膜的稳定性;根部定殖印度梨形孢的小麦细胞内抗氧化酶活性增强,活性氧自由基含量降低,胞内水含量提高,细胞膜稳定性增强;印度梨形孢定殖能改变由于病原菌引起的mRNA转录组变化,抗性相关基因的表达增强。综合表明印度梨形孢定殖能有效地提高小麦对禾谷镰孢菌的抗性。【结论】研究结果为深入理解植物与微生物互作、开发新型高效环保抗根腐病生物制剂提供理论和实验依据。     

印度梨形孢(Piriformospora indica)增强植物抗逆境胁迫能力的研究进展

印度梨形孢是一种可在多种植物根部定殖的内生真菌,能与多种植物形成共生体,提高植物对外界营养的吸收能力,促进次生代谢产物的积累,提高植物对生物及非生物胁迫的抵抗能力,同时可增加植物的生物产量,对宿主植物产生许多有益影响。因此,印度梨形孢作为优良的生物防治和土壤改良因子,在农业生产方面显示出巨大的应用前景。本文结合本课题组近年研究结果及近10年间相关科学工作者的研究,系统总结了印度梨形孢在增强植物抗生物胁迫与非生物胁迫方面的研究进展,旨在为更好地发挥其潜在价值提供参考。     

miRNA响应印度梨形孢定殖调控大麦生长发育的作用机制

【背景】内生真菌印度梨形孢(Piriformospora indica)定殖植物可以显著促进植物生长发育。miRNA已被证实在植物体的生长发育中具有调控作用。【目的】揭示印度梨形孢定殖大麦促进大麦生长发育过程中miRNA对印度梨形孢定殖的响应及对大麦生长发育的调控作用。【方法】提取大麦总RNA,实施转录组测序并进行序列比对与数据挖掘;使用高效液相色谱检测大麦生长素等激素水平变化。【结果】印度梨形孢对大麦有显著促生作用;全转录组测序结果显示：印度梨形孢侵染3 d较空白对照有18个差异表达的miRNA,其中11个miRNA上调、7个miRNA下调;侵染7 d与空白对照相比24个差异表达的miRNA,其中11个miRNA上调、13个miRNA下调;侵染3 d与侵染7 d相比有3个miRNA上调、6个miRNA下调。GO功能富集分析与KEGG通路分析显示,差异表达miRNA的靶基因主要参与转录、细胞分裂、生长素信号的感知和转导、光合作用和激素刺激响应。靶基因所参与的途径与大麦生长发育密切相关,暗示miRNA对印度梨形孢定殖过程做出了积极响应。代谢产物分析表明miRNA参与的调控路径的代谢产物发生改变。【结论】本研究以miRNA为入手点,探究了miRNA对大麦生长发育的调控机制,为揭示印度梨形孢的促生机制提供了新的研究方向。     

铁皮石斛内生真菌研究进展

目前已经从不同生境的铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)中分离到内生真菌252株,这些内生真菌涵盖了真菌门（Eumycota;Mycobionta）5个亚门中的半知菌亚门(Deuterornycotina)、担子菌亚门(Basidiomycotina)和子囊菌亚门（Ascomycotina）等3个亚门,已经鉴定的内生真菌分属于48个属。有些内生真菌对铁皮石斛的种子萌发和植株生长均有促进作用。对铁皮石斛内生真菌的多样性和分类、铁皮石斛内生菌与宿主的关系进行了综述,探讨研究中存在的问题, 并对今后研究方向提出建议。     

铁皮石斛DORCA基因的克隆及表达分析

为了研究铁皮石斛的光合特性,根据Rubisco活化酶(RCA)基因的保守序列设计兼并引物,采用RT-PCR和RACE方法从铁皮石斛叶中分离到一个RCA基因,命名为DORCA(GenBank登录号KT205841)。DORCA基因cDNA全长为1 724bp,包含1 317bp开放阅读框(ORF),编码438个氨基酸。系统进化分析显示,DORCA与马蹄莲ZaRCA(AAK25801.1)亲缘关系最近。生物信息学分析表明,DORCA与其他植物的RCA蛋白具有较高一致性,属于RCA的β亚基。DORCA蛋白具有定位于叶绿体的N端转运肽,2个保守的ATP结合结构域和多个磷酸化位点。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,DORCA基因在茎、叶中表达;在自然光周期条件下,DORCA基因在8:30时表达量最高,20:30时表达量最低,具有明显的光诱导表达特性。     

铁皮石斛内生真菌次生代谢产物研究

为了解铁皮石斛(Dendrobium officinale)内生真菌Phyllosticta aristolochiicola的次生代谢产物,从该真菌中分离得到15个化合物,经波谱分析分别鉴定为N-methyl-2-pyrolidinone (1)、环-(甘氨酸-L-脯氨酸)(2)、环-(D-丙氨酸-L-脯氨酸)(3)、环-(L-缬氨酸-L-脯氨酸)(4)、环-(L-亮氨酸-L-脯氨酸)(5)、cyclo-(L-Leu-D-4-hydroxyprolinyl)(6)、环-(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)(7)、环-(L-苯丙氨酸-L-4-羟基脯氨酸)(8)、环-(L-酪氨酸-L-脯氨酸)(9)、环-(L-苯丙氨酸-L-亮氨酸)(10)、啤酒甾醇(11)、对羟基苯乙醇(12)、对羟基苯乙酸(13)、(2S,3R)-1-(4-羟基苯基)丁烷-2,3-二醇(14)和(2R,3S)-1-苯基丁烷-2,3-二醇(15)。采用MTS法检测抗肿瘤活性表明,化合物2、10和14对HL-60、A-549、SMMC-7721、MCF-7和SW-480细胞株具有一定的抑制活性。     

转录组和代谢组分析瘤菌根菌对铁皮石斛的促生机制

为筛选出促进铁皮石斛(Dendrobium officinale)生长的差异表达基因和差异代谢物,对瘤菌根菌与无菌盆栽铁皮石斛苗共生后形成的侧根根系进行转录组、代谢组和双组学联合分析。结果表明,转录组分析共找到262条差异表达基因富集到了35条通路中,其中内质网蛋白质加工通路途径的差异基因最多,其次为氨基糖和核苷酸糖代谢通路。代谢组分析共检测出194个差异代谢物富集到33个KEGG通路中,其中代谢途径的差异代谢物最多有133个,其次为不同环境的微生物代谢途径的差异代谢物有70个。通过联合分析,有9个差异基因的差异表达导致丝氨酸、谷氨酸、D-甘露糖和激素等代谢物的积累量发生变化,这可能是瘤菌根菌促进铁皮石斛生长的重要原因。因此,推测瘤菌根菌促进铁皮石斛生长与氨基酸、糖、植物激素的积累及相关基因的表达变化有关。     

硝酸镧和兰科菌根真菌对铁皮石斛生理特性的影响

利用盆栽的方式研究了不同硝酸镧水平(0、1.0、3.0、5.0和7.0mg·L-1)下接种兰科菌根真菌对铁皮石斛生物量、多糖和蛋白质合成的影响,并分析了叶绿素含量、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的变化,以探讨硝酸镧和兰科菌根真菌对铁皮石斛生理特性的影响。结果表明:(1)添加适量的硝酸镧有利于菌根真菌侵染和菌根发育,提高铁皮石斛幼苗生物量。(2)在接种菌根真菌的同时添加5.0mg·L-1的硝酸镧,铁皮石斛的根重、茎叶重和总生物量均达到最大,分别是未添加硝酸镧以及未接种对照组的4.26倍、4.98倍和4.87倍,其菌根侵染率也高达92.8%;而且可显著提高叶片中叶绿素含量,并显著降低细胞内的丙二醛含量。(3)在适量(5.0mg·L-1)的硝酸镧水平下接种菌根真菌能促进铁皮石斛幼苗多糖和蛋白质的合成,并显著提高细胞内SOD、CAT和POD活性。研究认为,菌根真菌与适宜浓度硝酸镧(5.0 mg·L-1)联合使用能显著促进铁皮石斛菌根的形成,增强植株的生理活性和适应能力,提高其生物量和多糖等活性成分的积累,有效改善铁皮石斛的药用品质。