新方法新技术与新型抗生素发现

日趋严峻的细菌耐药性问题给“抗生素传奇时代”带来了严重威胁, 传统的抗菌药物开发手段已很难应对, 因此急需新思路来寻找新型抗生素。近年来, 一些新方法新技术如新型筛选模型的构建、基因组挖掘技术以及组合生物合成等给天然产物的筛选引发了革命性的变革, 也为放线菌来源的新型抗生素的发现带来了新的希望。本文将对这些新技术及其在新型抗生素研发中的应用进展进行阐述。     

放线菌来源活性天然产物发现研究进展

放线菌(Actinomycetes)是抗生素等活性天然产物的重要来源，在临床治疗病原菌感染等重大疾病方面发挥着重要作用。由于抗生素滥用等原因导致临床上出现的以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)等为代表的耐药病菌的种类和数量急剧增加，对人类生存造成了重大威胁。结合现代生物技术进展，加大放线菌来源新抗生素的开发力度刻不容缓。本文对新时期放线菌来源抗生素的发现现状、基于生理操作和基因操作的放线菌来源天然产物挖掘的技术方法等进行综述，以期对放线菌来源活性天然产物的发现提供借鉴。     

微生物中抗耐药菌活性天然产物的研究进展

近年来,细菌耐药性已成为全球性问题。微生物作为抗生素的重要来源,在发掘抗耐药菌新型抗生素的研究中承担了重要角色,许多微生物来源天然化合物展现了显著的抗耐药菌活性。本文主要综述了近十年发现的微生物源抗耐药菌天然化合物,并概括了抗耐药菌活性天然产物的筛选方法,以期对抗耐药菌新型抗生素的发现做铺垫。     

CRISPR/Cas9在放线菌合成生物学研究中的应用和发展

放线菌是活性天然产物和抗生素药物的重要来源。利用合成生物学高效地开发其中丰富的天然产物资源,将为加速新药开发奠定坚实的基础。CRISPR/Cas9作为一种多功能基因编辑系统,因其便捷高效而被广泛应用于真核生物的遗传操作。但在原核生物尤其是放线菌中的应用仍处于起步阶段,机遇和挑战并存。本综述总结了目前CRISPR/Cas9系统在放线菌基因编辑和调控,以及活性天然产物的产量提升、生物合成机制解析和资源开发等方面的研究进展。同时,也对该系统在应用中面临的包括重组修复效率低,以及靶向切割效率不足等关键挑战进行了分析,并提出了相应的优化解决方法。随着CRISPR/Cas9在放线菌应用中的不断完善和发展,将极大地推动放线菌的合成生物学研究,促进其中天然产物资源的有效挖掘和应用开发。     

环境未培养微生物中新型抗生素的发掘研究进展

抗生素耐药基因的快速扩散和传播导致现有抗生素对耐药致病菌的疗效降低甚至失效,因此迫切需要开发新型抗生素.然而,利用经典的筛选可培养微生物的方法已难以获得新型抗生素.同时,新型抗生素的发掘不仅能为对抗耐药致病菌提供解决方案,还能为挖掘其他天然产物并构建微生物细胞工厂提供理论依据和实践指导.微生物组学和合成生物学的发展为新...     

天然海鱼共附生放线菌抑菌和抗病毒活性筛选研究

从台湾海峡天然海鱼共附生微生物群落分离得到29株放线菌,通过抗病毒和抑菌活性筛选,分别得到6株对烟草花叶病毒和植物病原真菌具有较强抑制作用的天然菌株.其中,菌株030603对供试植物病原真菌拮抗作用尤为显著,其发酵产物具有广谱抑菌活性,可以作为广谱性植物病原真菌拮抗菌株进行生防菌产业化开发及发酵产物活性成分的化学研究.该菌株形态特征、培养特性、生理生化特性与微白黄链霉菌基本一致,16 S rDNA序列同源性达99.5 %.实验结果表明,利用天然海洋鱼类共附生微生物群落获取植物病原菌拮抗菌株具有取样便捷和活性菌株检出率高的特点.     

新型angucycline/angucyclinone类天然产物的研究进展 (2010–2020)

Angucycline/angucyclinone类天然产物是Ⅱ型聚酮类化合物中一个庞大的家族,其产生菌广泛存在于自然界中。由于这类化合物具有丰富的生物活性和独特的化学结构,吸引了众多科学家的浓厚兴趣。随着合成生物学的发展和特殊环境来源放线菌资源的开发,不断有新骨架的angucycline/angucyclinone类天然产物被发现,极大地丰富了这一家族天然产物的结构多样性。本文对2010–2020年期间,利用改变培养条件、基因改造、基因组挖掘、活性导向、特殊环境来源放线菌培养等不同策略从放线菌中所发现的新型angucycline/angucyclinone类化合物进行综述,并对合成生物学方法在这类化合物的发现和开发中的作用进行了讨论。     

不同培养基对放线菌TRM10325抑制群感效应活性的影响

检测不同培养基条件下,放线菌TRM10325发酵液抑制群感效应的活性,初步了解其活性稳定性,并为筛选最优发酵培养基提供实验依据。选取17种合成培养基、26种天然培养基发酵放线菌TRM10325,采用微孔板半定量法检测其对紫色素杆菌群感效应以及表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制作用。不同配方的培养基对放线菌10325抑制群感效应活性的影响也不相同,其中Am6培养基抑制群感效应效果最佳。成分不同的培养基,明显影响微生物不同次级代谢产物的产生。同一微生物在不同培养基中发酵,其次生代谢产物的种类和含量变化很大。最终选定Am6培养基为最适发酵培养基。     

红树林链霉菌ZFSM1-146中抗菌活性物质的发现

【背景】红树林来源的放线菌蕴含着丰富的次级代谢产物资源,是挖掘小分子药物的重要来源。【目的】对红树林放线菌天然产物进行研究,分离和鉴定其中的抗菌活性化合物。【方法】采用稀释涂布平板法分离纯化红树林土壤中的放线菌,通过琼脂块法初筛和滤纸片法复筛获得具有抗菌活性的放线菌;基于16SrRNA基因序列分析和系统发育树构建确定目标放线菌种类;通过高效液相色谱法对目标放线菌的发酵产物进行分析,采用硅胶柱层析和高效液相色谱分离技术结合的活性追踪法纯化抗菌活性物质;经高分辨电喷雾电离质谱和核磁共振波谱技术鉴定抗菌活性物质的结构。【结果】从红树林土壤中筛选到一株抗菌活性较强的放线菌ZFSM1-146,16SrRNA基因序列及其基因片段构建的系统发育树分析初步确定其为抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus);菌株ZFSM1-146可产生抗菌活性化合物1-3,化合物1-3经结构鉴定分别为放线菌素X_(Oβ)、X_2和D。经培养基初步优化,抗菌活性最强的放线菌素X2的产量约达到原来的2倍。【结论】从红树林土壤中筛选出一株可产生抗菌活性物质的抗生链霉菌ZFSM1-146,并鉴定出3个抗菌活性成分均为放线菌素类化合物,为后续进行放线菌素的产量优化和通过分子遗传手段进行结构改造提供了宝贵的菌种资源。     

西藏仲巴五彩沙漠放线菌资源勘探及生物活性筛选

【背景】细菌耐药性问题日益严峻,新抗生素的研发速度远远落后于临床需要,从特殊生境中挖掘微生物药物资源有望解决以上问题。【目的】勘探西藏仲巴五彩沙漠土壤放线菌多样性并进行生物活性筛选,为发现药用放线菌资源、开发新型抗生素奠定基础。【方法】采用8种分离培养基,通过平板稀释涂布法分离放线菌;根据分离菌株的16S r RNA基因序列同源性分析放线菌多样性;采用PCR技术对分离的放线菌菌株进行II型聚酮合酶(PKS-II)酮缩酶结构域KS、非核糖体多肽合成酶(NRPS)腺苷酸化结构域A、安莎类抗生素生物合成前体3-氨基-5-羟基-苯甲酸合酶(AHBA)保守区、黄素腺嘌呤二核苷酸卤化酶(Halo)保守区抗生素生物合成基因检测;对生物合成基因检测阳性的菌株进行液体发酵,发酵液经乙酸乙酯萃取、菌体经丙酮浸提,获得提取浓缩物样品进行抑菌活性和抗氧化活性筛选。【结果】从4份土样中分离纯化到231株放线菌,分布于7个属,其中链霉菌为优势菌属。68株放线菌的生物合成基因分析显示至少具有1种生物合成基因簇,其中6株同时具有4种生物合成基因簇;进一步的抑菌活性检测显示所有检测的菌株至少表现为对1株检定菌具有抑菌活性,其中8株具有广谱抗菌活性;抗氧化活性筛选结果为13株显示总抗氧化能力阳性,10株具有较好的羟自由基清除能力,3株显示较强的氧自由基清除能力。【结论】西藏仲巴五彩沙漠土壤中含有较丰富的放线菌药用资源,具有从中发现放线菌新菌种和开发新抗生素的潜力。     

来自西双版纳3种有毒植物的免培养与纯培养放线菌多样性及生物活性

【背景】由于土壤放线菌中获得新化合物日益困难,抗生素滥用使致病菌耐药性不断增加,人们转向研究植物内生放线菌以期发现新化合物。【目的】探究西双版纳热带雨林有毒植物内生放线菌的多样性,为开发新药提供具有潜在生物活性的菌株。【方法】通过Illumina Hi Seq高通量测序和纯培养方法分析箭毒木、八角枫、马缨丹3种有毒植物的内生放线菌群落结构组成,利用纸片扩散法筛选抑菌活性,通过PCR扩增检测7类化合物合成基因。【结果】高通量测序的多样性分析和群落结构分析得出:3种有毒植物在门分类水平检测出古菌域的2个门、细菌域的18个门和暂定的Rsa HF231、WD272门;在属分类水平检测出30个属的放线菌,八角枫和马缨丹的微生物群落结构比箭毒木更丰富。纯培养分离获得11个属34株菌,分离自箭毒木的菌株比八角枫和马缨丹的菌株更多,而且大多数高通量检测出的菌种不能通过纯培养获得。抑菌活性检测结果显示:抗菌活性作用明显的菌株以链霉菌属为主。链霉菌属的NRPS和PKS基因的检出率明显高于其他化合物合成基因。【结论】有毒植物内生放线菌多样性非常丰富。有毒植物内生放线菌具有合成次生代谢产物的潜力,可以为生物农药及抗生素开发提供丰富的菌种资源。     

Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration?

There are few new antibiotics in the pipeline today. The reasons may include starvation at the front of the pipeline due to inadequate sources of suitable compounds to screen coupled with poorly validated discovery methodologies. A successful antibiotic discovery approach in the past, based upon whole cell antibiotic screening of natural products from actinomycetes and fungi, eventually suffered from constipation in the middle of the pipeline due to rediscovery of known compounds, even though low throughput methodology was employed at the front end. The current lack of productivity may be attributed to the poor choice of strategies to address the discovery of new antibiotics. Recent applications of high throughput in vitro screening of individual antibacterial targets to identify lead compounds from combinatorial chemical libraries, traditional chemical libraries, and partially purified natural product extracts has not produced any significant clinical candidates. The solution to the current dilemma may be to return to natural product whole cell screening. For this approach to work in the current millennium, the process needs to be miniaturized to increase the throughput by orders of magnitude over traditional screening, and the rediscovery of known antibiotics needs to be minimized by methods that can be readily monitored and improved over time.     

高通量自动化微生物微液滴进化培养与筛选技术及其装备化

液滴微流控由于可以快速生成大量微液滴,并实现单个液滴独立的控制,每个液滴都可以作为独立的单元进行微生物培养,因此在微生物的高通量培养方面具有独特的应用优势.然而现有研究多停留在实验室搭建和使用阶段,存在操作要求高、影响因素多、缺乏自动化集成技术等关键问题,制约了液滴微流控技术在微生物研究中的应用.文中以解决液滴微流控技...     

常压室温等离子体诱变育种与微生物液滴培养筛选技术应用进展

安全和高效的微生物突变及高通量筛选技术是微生物功能发掘、功能创制和生物产业技术创新的重要方向及重要支撑.有效的生物育种技术及高通量筛选技术成为该领域研究人员的关注点.其中,常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)因具有活性粒子种类多、操作可控性强、基因...     

放线菌代谢产物的研究进展：基于Web of Science (WOS)和中国知网(CNKI)

【背景】放线菌是一类极其重要的微生物,代谢产物丰富,在医药、生物技术、农业和酶工业等领域均有广泛应用。【目的】客观分析放线菌代谢产物的研究进展,为该领域相关工作人员提供有效情报,推动该领域高质量发展。【方法】对Web of Science (WOS)和中国知网(China National Knowledge Infrastructure, CNKI)数据库中放线菌代谢产物的发文数量、发文国家、发文机构、发文期刊、发文出版社、发文作者、被引文章和研究方向进行统计分析,利用H指数对相关影响力进行综合评价,其研究热点、发展趋势通过Cite Space和VOSviewer软件进行可视化分析。【结果】WOS结果显示,放线菌代谢产物研究领域全球影响力最大的国家是美国,影响力最大的机构是美国加利福利亚大学,影响力最大的期刊是美国Applied and Environmental Microbiology,影响力最大的出版社是Elsevier,影响力最大的作者是来自英国约翰英纳斯研究中心微生物学部的Mervyn J Bibb教授。全球放线菌代谢产物领域的主要研究方向是微生物学,研究热点是生物合成。研...     

广西北部湾茅尾海红树林生境放线菌分离培养基的比较

【背景】红树林生境拥有丰富的微生物资源,分离获得更多的纯培养放线菌为新型抗生素的发现提供菌种资源。【目的】使用新型放线菌分离培养基,发掘广西北部湾茅尾海红树林生境放线菌资源,评估新型放线菌分离培养基分离效果。【方法】设计出新型放线菌分离培养基——椰子汁-海藻糖培养基,对广西北部湾茅尾海红树林根际土壤和红树林根皮放线菌进行分离。基于分子生物学鉴定方法,对获得的纯培养放线菌进行多样性分析。【结果】从红树林根际土壤样品中分离获得65株放线菌,分布在5个目10个科15个属,使用YIM171培养基分离到7个属,MA培养基分离到5个属,椰子汁-海藻糖培养基分离到11个属,其中包括4株潜在新种;从红树林根皮样品中分离获得19株放线菌,分布在4个目7个科10个属,使用YIM171和椰子汁-海藻糖培养基分别分离到7个属,包括4株潜在新种;使用椰子汁-海藻糖培养基在红树林生境两类样品中获得3株潜在新种。【结论】广西北部湾茅尾海红树林根际土壤和根皮中放线菌多样性丰富,使用椰子汁-海藻糖培养基分离放线菌效果较佳,可用作放线菌的分离培养基。     

可培养海洋放线菌生物多样性的研究进展

海洋放线菌是新药开发和天然活性产物的重要来源,海洋放线菌的生物多样性是代谢产物功能多样性的基础,因此研究可培养放线菌的生物多样性具有重要的意义。综述了近年来可培养的海洋放线菌生物多样性的研究进展,尤其是海绵共附生放线菌、深海放线菌和海洋固有放线菌的研究进展,对可培养的海洋放线菌的分离培养方法,包括样品处理、培养基的选择等进行了重点介绍,并对未培养海洋放线菌的分离培养进行了探讨,强调了建立区域性海洋放线菌菌种及基因资源库的重要性。     

Pharmaceutically active secondary metabolites of marine actinobacteria

Marine actinobacteria are one of the most efficient groups of secondary metabolite producers and are very important from an industrial point of view. Many representatives of the order Actinomycetales are prolific producers of thousands of biologically active secondary metabolites. Actinobacteria from terrestrial sources have been studied and screened since the 1950s, for many important antibiotics, anticancer, antitumor and immunosuppressive agents. However, frequent rediscovery of the same compounds from the terrestrial actinobacteria has made them less attractive for screening programs in the recent years. At the same time, actinobacteria isolated from the marine environment have currently received considerable attention due to the structural diversity and unique biological activities of their secondary metabolites. They are efficient producers of new secondary metabolites that show a range of biological activities including antibacterial, antifungal, anticancer, antitumor, cytotoxic, cytostatic, anti-inflammatory, anti-parasitic, anti-malaria, antiviral, antioxidant, anti-angiogenesis, etc. In this review, an evaluation is made on the current status of research on marine actinobacteria yielding pharmaceutically active secondary metabolites. Bioactive compounds from marine actinobacteria possess distinct chemical structures that may form the basis for synthesis of new drugs that could be used to combat resistant pathogens. With the increasing advancement in science and technology, there would be a greater demand for new bioactive compounds synthesized by actinobacteria from various marine sources in future.     

波罗的海放线菌的多样性

摘要:【目的】为了探索海洋放线菌的多样性,为发现新的药物先导化合物提供新菌源,我们分析了波罗的海的放线菌多样性及生物活性。【方法】采集100 份底泥样品,用7 种培养基分离放线菌809 株;去掉相同菌株后,选择280 株代表菌进行了初步分类鉴定;采用琼脂扩散法,检测了它们对5 种细菌、真菌的抗菌活性;用API ZYM system 测定了21 种酶的活性。【结果】用海藻糖-脯氨酸培养基和HV 培养基分离的放线菌中,稀有放线菌占60% 和63% ;波罗的海的放线菌有15 个属,其中3 个属是首次从海洋中分离     

智利海洋沉积物中放线菌多样性

【目的】认识智利海洋沉积物中放线菌的多样性。【方法】分别采用选择性分离培养和非培养的基于16SrRNA基因序列系统发育分析方法,对来自智利南部海域海洋沉积物中放线菌多样性进行研究。采用6种选择性分离培养基分离放线菌;利用放线菌特异性引物对样品总DNA进行16SrRNA基因序列扩增并构建了16SrRNA基因克隆文库。分别挑选不同培养特征的22株放线菌和59个基因克隆进行16SrRNA基因序列的系统进化分析;测定分离的放线菌对海水的依赖性及产生抗菌活性化合物的能力。【结果】共分离到328株放线菌;挑选的22株放线菌分别属于小单孢菌属、多形孢菌属、链霉菌属、迪茨氏菌属、气微菌属和短状杆菌属;挑取的59个克隆属于40个分类单元,其中60%分类单元属于放线菌门放线菌亚纲、酸微菌亚纲和红色杆菌亚纲,另外40%的分类单元在放线菌内形成几个独立的进化分支,有可能代表放线菌新类群。22株放线菌有19株具有抗菌活性,50%的生长依赖海水的放线菌也具有抗菌活性。【结论】智利海域沉积物存在丰富的放线菌系统发育多样性并能产生活性次级代谢产物,而且还蕴藏丰富的新类型的放线菌资源。