嗜酸氧化亚铁硫杆菌启动子探针载体的构建

目的：为了研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）启动子结构与功能。方法：以pSV-β-galactosidase质粒为骨架,通过定点突变的方法引入一个新的BstBⅠ单酶切位点,构建能在大肠杆菌（Escherichia coli）中正常复制的启动子探针载体。利用PCR的方法将A.ferrooxidans菌cycA2基因上游5＇段上游DNA片段克隆到探针载体β-半乳糖苷酶基因上游以替代其原有启动子（gpt启动子）,并将重组的质粒转化E.coliDH5α菌株。通过检测宿主细胞的β-半乳糖苷酶活性,来鉴定启动子片段,并分析了启动子探针质粒载体的功能及启动子的强度。结果：pSV-β-galactosidase质粒被正确突变,成功构建了启动子探针载体pSVB。来源于A. ferrooxidans菌的启动子片段可驱动β-半乳糖苷酶基因在E.coli细胞中表达,转化子酶活性约为gpt 启动子驱动下活性的70 %。结论：启动子探针载体（pSVB）可用于A. ferrooxidans菌或者其它原核生物启动子的分离及进一步的分析研究。酶活性分析结果表明,来源于A. ferrooxidans菌cycA2基因上游5＇段上游DNA片段具有显著启动子活性。     

红球菌启动子识别及b-半乳糖苷酶报告基因表达

红球菌属在生物降解、生物修复、生物转化和生物表面活性剂等领域得到了日益广泛的应用。本研究以红球菌-大肠杆菌穿梭质粒pNV18.1为载体,以腈水合酶为模式酶,研究了大肠杆菌tac、lacZ启动子和红球菌酰胺酶启动子(ami-1/ami-2)在红球菌中的启动效率。结果表明,启动子Ptac、Pami-1(7bpSD-ATG间隔)、Pami-2(13bpSD-ATG间隔)和PlacZ在紫红红球菌ATCC33278中启动表达腈水合酶的比酶活分别是野生菌株的7.5、6.3、5.3和1.8倍,表明这些启动子都可以被红球菌的RNA聚合酶所成功识别。采用PlacZ启动子在红球菌宿主中启动β-半乳糖苷酶报告基因(lacZ),结果表明,lacZ能够在红球菌中高效表达,是优选的红球菌报告基因。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因启动子的分离和鉴定

用启动子探针型载体pFR109从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)总DNA中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β-半乳糖苷酶基因的表达。对其中Y8片段的进一步分析结果表明:该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Y8片段再次转入供体酵母时,它仍能启动β-半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去掉Y8片段5′端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。     

鸡痘病毒载体启动子的优化

要提高外源基因在鸡痘病毒（ＦＰＶ）载体的表达量,必须使用强启动子来控制表达。为构建较强的启动子组合,根据痘苗病毒天然启动子Ｐ７．５的结构,人工合成４条寡核苷酸,形成一个早期启动子和一个晚期启动子,其首尾可相互连接。利用分子生物学常用实验方法把合成的启动子进行不同组合,最终形成１０个较有代表性的启动子组合ＰＳ１￣１０。在其下游插入大肠杆菌β－半乳糖苷酸基因ＬａｃＺ,并进一步构建成鸡痘病毒转移载体ｐＦ     

β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶共表达一步法催化乳糖到塔格糖

[目的]构建一株以廉价原料乳糖为底物合成塔格糖的重组菌株,实现一步法高效生物合成稀有糖——塔格糖.[方法]从Escherichia coli K-12基因组中,PCR扩增出阿拉伯糖异构酶araA和β-半乳糖苷酶lacZ基因,以SD-AS为连接子,利用pET28a-1载体串联表达于Escherichia coli BL2...     

以β-半乳糖苷酶为报告基因的原核启动子检测体系构建

目的:以β-半乳糖苷酶为报告基因构建原核启动子检测体系.方法:以由质粒 pDL 扩增获得的 bgaB 基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体 pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBEB.将组成型启动子P43和诱导型启动子Pcpac克隆入 pBEB,得到重组表达载体 pBEBP43 和 pBEBPapac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌.结果:两种不同类型的启动子均能在大肠杆菌 BL21 和枯草芽孢杆菌 1A751 中启动 bgaB 基因的表达.结论:成功构建具有较为广泛适用性的原核启动子检测体系.     

泰山土壤宏基因组DNA中耐热β-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及性质

从泰山土壤宏基因组文库中发现可能的β-半乳糖苷酶基因pwtsA,将其克隆到表达载体pET30a,转化E. coli BL21(DE3).工程菌在IPTG诱导下高效表达可溶性的重组蛋白PWTSA,分子量为57 kD,与预期大小一致.PWTSA能够水解ONPG产生o-硝基酚,酶活力为13.6 U/mg,确证了重组蛋白为β-半乳糖苷酶.PWTSA的最适反应温度在85℃-95℃之间,最适pH值为6.5,对90℃左右的高温有很好的耐受力.在标准反应条件下,酶作用于底物ONPG的米氏常数Km为0.83 mmol/L.     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GAL1的穿梭表达质粒pYESZ中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4－3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β-半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β-卜半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4－3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β-半乳糖苷酶在pep4－3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。     

基于启动子捕获系统的水稻基因的分离

为了分离水稻的基因及其启动子,该实验室构建了T-DNA(GUS)结构的水稻启动子捕获系统,对其中编号为113#、T-DNA单拷贝插入、GUS报告基因为组成型表达的阳性捕获系进行了进一步分析。潮霉素筛选结合GUS组织化学染色获得了T-DNA插入的纯合株(113#-22和113#-26);Inverse法分离得到T-DNA插入位点水稻基因组DNA旁邻序列,测序和BLAST结果表明,T-DNA反方向插在水稻基因组4号染色体预测基因的内含子中;扩增T-DNA插入位点上游2kb左右DNA片段,构建启动子分析质粒转化水稻‘中花11’胚性愈伤组织,获得转基因植株,GUS组织化学染色模式与113#阳性株系一致。结果表明,该预测基因及其启动子是利用启动子捕获系统所捕获到的候选基因。     

嗜盐古菌启动子DNA片段的功能检测

将来源于嗜盐古菌染色体DNA的启动子片段RM07或RM13插入到启动子探针载体pYLZ_2的报告基因lacZ之前,通过β_半乳糖苷酶酶活性的检测,进一步确证RM07和RM13片段在大肠杆菌(Escherichia coli)中的启动功能。同时用微量热技术检测了大肠杆菌DH5α及其重组菌株在LB培养基中37℃生长过程的热输出功率。T2(pYLZ_2)、TE07(pYL726)、TE07_2(pYL702)、TE131(pYL131)和TE132(pYL132)菌株的生长速率分别比大肠杆菌DH5α降低了6.5%、11%4、1.1%4、7.5%和42.7%。当启动子启动了基因表达时,菌株的生长速率显著降低,热力学参数与酶活性检测结果有较好的一致性。微量热结果表明基因的表达比质粒DNA的复制过程需要消耗更多的能量,对细菌的生理代谢有较大改变。微量热技术为检测基因的表达和转录调控提供了新的方法和思路。     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

基于萤火虫荧光素酶报告基因检测凋亡的系统构建及鉴定

为构建一个能够快速检测凋亡的含荧光素酶报告基因 (Fluc) 的真核表达质粒,采用PCR的方法将Caspase-3的识别基序Asp-Glu-Val-Asp (DEVD) 四个氨基酸引入至Fluc基因的C端和N端之间;同时选取Asp-Glu-Val-Gly (DEVG) 四个氨基酸作为阴性对照。随后重组片段分别克隆至分离型内含肽的N端和C端之间,并命名为pFluc-DEVD和pFluc-DEVG。将该表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒 (RLUC) 同时转染至HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因和Western blotting实验检测细胞凋亡水平。双荧光素酶报告基因系统实验结果显示,当发生凋亡时,pFluc-DEVD质粒组表达的萤火虫荧光素酶的含量高出pFluc-DEVG质粒组约3倍。Western blotting检测结果显示,转染pFluc-DEVD质粒的细胞在凋亡药物刺激后,Fluc活化的蛋白显著增多,且Caspase-3 的活化程度与Fluc的表达呈正相关,并有显著的统计学差异。以上结果表明,pFluc-DEVD真核表达质粒表达的萤火虫荧光素酶蛋白能被细胞内的Caspase-3酶裂解,且该质粒能够精确地反映出细胞的凋亡水平,为后续进行凋亡定量检测提供了一个可借鉴的方法。     

Expression of lacZ reporter gene under the control of the polyhedrin promoter of Spodoptera litura nuclear polyhedrosis virus

Promoter function of the putative polyhedrin-encoding gene (polh) of Spodoptera litura nuclear polyhedrosis virus (S1MNPV) was determined by transferring it to the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) through the AcNPV polh based vector, pVL1393. Three transfer vectors pCBT2, pCBT3 and pCBT4 were constructed by substituting the promoter and the neighbouring sequences of AcNPV in pVL1393 by that of SINPV. The Escherichia coli lacZ gene was placed downstream from the S1NPV polh promoter in the hybrid transfer vector (pCBT) constructs. Co-transfection of Spodoptera frugiperda cells (Sf9) with each of the pCBTlacZ vector and wild-type AcNPV DNAs led to synthesis of β-galactosidase (βGal). The plaque-purified recombinant viruses (S1AcNPV.lacZ) expressing lacZ under the polh promoter of S1NPV are stable. The highest βGal activity was obtained with S1AcNPV4.lacZ. Production of βGal with recombinant virus, S1AcNPV3.lacZ in which S1NPV polh promoter is in the reverse orientation in the AcNPV genome, is 83% of that produced by S1AcNPV4.lacZ. These results indicate that the S1NPV polh promoter is active in the genetic environment of AcNPV; the polh of S1NPV is phylogenetically related to AcNPV like other baculoviruses.     

一种利用基因表达变化检测、鉴别抗生素的新方法

本研究利用基因表达变化构建一个高通量检测筛选抗生素化合物的新方法。采用含luxCDABE报道子的质粒pCS26和pMS402为载体,构建大肠杆菌重组质粒、筛选铜绿假单胞菌以及沙门氏菌的随机启动子库,获得对抗生素有反应的启动子-报道子融合体,构成抗生素筛选体系。通过重复实验筛选出15个启动子-报道子融合体,它们对不同抗生素有不同的反应,通过这一系统可以检测样品中的抗生素,并初步判断与现有抗生素的异同。使用这种方法可以进行高通量筛选潜在的抗菌物质。     

Expression of microinjected reporter gene lacZ during first cleavages of rabbit embryos

The growing use of reporter genes in a model transgenic system has been a fundamental approach of biology, but the strategy of transgenic embryo selection prior to transfer to foster mothers may greately increase the efficiency of transgenic livestock production. This study was conducted to assess the possibility of beta-galactosidase (beta-gal)-labeled transgenic rabbit embryo production. Rabbit zygotes were obtained from superovulated females after mating. Zygotes were microinjected into male pronuclei with pCMV-lacZ or SV40-lacZ constructs; while some embryos were co-injected with the scaffold attachment sequences--SAR. Embryos from control non-injected and microinjected groups were cultured in vitro. After 24, 48, 72, or 96 h of culture the embryos were stained with X-gal for beta-galactosidase. Transgenic embryos produced by pronuclear injection showed a discrete pattern of beta-galactosidase expression. The percentage of transgenesis with pCMV-lacZalone was 1.5, but with SAR sequences it increased to 4.2. In the case of SV40-lacZ construct, the efficiency of transgenesis was 2.3% and 4.1%, respectively. The mosaicism was 66.7% for all embryos injected with both constructs with or without SAR. The highest numbers of 100%-transgenic (non-mosaic) embryos were found in the group co-injected with SV40-lacZ and SAR. Transgenesis was seen as early as 24 h after injection, in four-cell embryos. Most of the microinjected embryos showed delayed development as compared with control. It was concluded that lacZ may serve as a reliable reporter for early transgenic embryo selection in order to produce transgenic animals.