胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中能量代谢变化的研究

目的：定向诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞，对分化过程中胚胎干细胞、心肌祖细胞和心肌细胞糖酵解能力和线粒体氧化磷酸化能力进行实时定量检测，探索分化过程中细胞能量代谢表型的转换机制.方法：用GSK3抑制剂CHIR99021和Wnt信号通路小分子抑制剂IWP2的方法定向分化人胚胎干细胞为心肌祖细胞和心肌细胞；细胞免疫荧光检测人胚胎干细胞标志物，流式细胞术检测人心肌祖细胞和心肌细胞标志物；应用细胞外流量分析（Extracellular Flux Analysis）方法检测人胚胎干细胞、心肌祖细胞和心肌细胞能量代谢情况.结果：人胚胎干细胞干性保持稳定，均表达Nanog、OCT4、SOX2细胞标志物；在向心肌分化过程中，第7d心肌祖细胞标志物Isl1表达99%以上，分化第15d心肌细胞标志物cTnT表达83%以上；人胚胎干细胞糖酵解代谢能力最强，心肌细胞线粒体功能最强，心肌祖细胞处于两种代谢方式的过度阶段.结论：在人胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程中，细胞糖酵解能力逐渐减弱，线粒体氧化磷酸化能力逐渐增强，细胞的能量代谢类型发生转变.     

心脏成纤维细胞旁分泌能力影响小鼠胚胎干细胞的命运（英文）

本研究旨在探讨心脏成纤维细胞旁分泌能力对小鼠胚胎干细胞的影响。新生小鼠和成年小鼠成纤维细胞的条件培养基(ConM-NCF、ConM-ACF)分别稀释50倍(1:50)或5倍(1:5),通过RT-real time PCR技术、ELISA、细胞增殖检测以及计数心肌分化过程中跳动拟胚体(embryoid body, EB)的比例,观察这些条件培养基对小鼠胚胎干细胞的影响。结果显示,成纤维细胞细胞因子的分泌能力在发育过程中发生显著变化,其中白细胞介素6 (interleukin 6, IL6)随发育成熟显著增加。ConM-NCF抑制干细胞的增殖,但高、低浓度对干性基因表达的作用不同。Con M-ACF 1:50促进干细胞增殖并上调干性基因,但Con M-ACF1:5作用相反。ConM-NCF和ConM-ACF都能抑制干细胞的心肌细胞分化能力,但又各有特点:ConM-NCF 1:50抑制早期心肌分化但不影响晚期心肌细胞标记物的表达;ConM-ACF 1:50抑制早期心肌分化比ConM-NCF 1:50更显著,阻碍心肌成熟并上调分化晚期的心肌细胞标记物表达水平。此外,IL6中和抗体抑制ConM-ACF 1:50对干细胞的促增殖作用,但不影响ConMNCF 1:50的作用。干细胞分化过程中长期应用IL6中和抗体,抑制早期心肌细胞分化,但对晚期分化不产生影响。以上结果提示,心脏成纤维细胞分泌的细胞因子种类和浓度都对小鼠胚胎干细胞的增殖、干性基因表达和心肌分化有重要意义,其中ConM-ACF分泌的IL6是干细胞干性维持和心肌细胞分化的有利因素。     

心肌样微环境诱导脂肪干细胞分化的研究

微环境在促进干细胞分化过程中起着重要的作用,研究心肌样微环境介导脂肪干细胞向心肌细胞分化有重要意义．将脂肪干细胞与心肌细胞直接或通过细胞培养小室间接共培养,检测脂肪干细胞的分化情况．对于直接共培养体系,采用绿色荧光蛋白CFSE对脂肪干细胞进行标记,然后与心肌细胞以1∶5混合后进行直接共培养,2周后,通过流式细胞仪分选分化的脂肪干细胞,并检测其分化情况．检测方法包括：扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构;免疫细胞化学检测心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)、肌钙蛋白(TnⅠ)和连接蛋白(Cx43);Western blot定量分析;RT-PCR检测心脏特异性转录因子mRNA的表达．结果表明,分化的脂肪干细胞呈现心肌样超微结构,并表达心肌特异性蛋白和转录因子,并且直接共培养体系中分化的脂肪干细胞其表达率明显高于间接共培养体系中的表达率．因此,在心肌样微环境中,除了可溶性细胞因子对分化起作用以外,心肌细胞产生的机械牵拉对脂肪干细胞向心肌细胞分化也起着重要的作用．     

血管紧张素Ⅱ在胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

为检测血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AⅡ）对小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向心肌细胞方向分化的作用,采用10-4 mol/L维生素C诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为心肌细胞. Western印记检测胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中表达血管紧张素Ⅱ1 型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R).诱导分化期间用1 μmol/L AⅡ刺激胚胎干细胞,计数搏动拟胚体的比例;诱导分化第14 d用real-time RT-PCR 和Western 印记检测心肌标志物的表达确定其作用. 结果显示,与对照组相比,1 μmol/L AⅡ处理组可显著增加搏动拟胚体的比例,上调心肌标志物mRNA的表达. 预先用1 μmol/L洛沙坦处理1 h后可显著阻碍这种上调作用. 本实验结果表明,AⅡ通过AT1R可促进小鼠R1胚胎干细胞向心肌细胞分化.     

小鼠胚胎干细胞分化心肌细胞血管紧张素Ⅱ 1型和2型受体的表达特征

胚胎干细胞(ESC)具有无限增殖和分化为体内3个胚层来源的各种类型组织细胞的潜能,经过体外诱导能够分化为心肌细胞,亦称为胚胎干细胞分化心肌细胞(ESCM).本研究探讨了ESC诱导分化心肌细胞过程中血管紧张素Ⅱ受体(ATR)的亚型AT1R和AT2R的表达特征.10-4mol/L维生素C体外诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为自发搏动的心肌细胞,用免疫荧光法检测分化后的细胞表达心肌细胞特异性标志物α辅肌动蛋白.小鼠胚胎干细胞在诱导分化为心肌细胞以后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real-timeRT-PCR)方法检测到ESCM表达AT1R,并且呈时间依赖性逐渐增加的特点,在第14d达到高峰.Western印记法检测AT1R表达特征与RT-PCR结果相符.Western印记法的结果显示,血管紧张素Ⅱ(10-6mol/L)可作为AT1R激动剂激活AT1R,并使其下游的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)磷酸化水平上调,预孵育AT1R抑制剂Losartan(10-6mol/L),此作用被抑制.RT-PCR方法显示,与新生小鼠心室肌细胞相比,ESCM的AT2R表达水平较低.     

Apelin/APJ 与胚胎心肌分化

胚胎发育中心脏祖细胞迁移至生心区并分化为心肌细胞是心脏形成的基础。研究心肌分化对了解心脏发育异常以及应用干细胞治疗缺血性心脏病具有重要意义。最近研究发现apelin/APJ信号通路与祖细胞的迁移及心肌分化有关。本文就apelin/APJ与胚胎心肌分化的关系做一综述。     

三氯乙烯对人胚胎干细胞心肌分化的影响和机制

目的:探讨三氯乙烯(TCE)对人胚胎干细胞心肌发育分化的影响。方法:以人胚胎干细胞H9体外心肌定向分化为模型,分化培养液中添加不同剂量的TCE(分别为处理组100 ppb组,1 ppm组,10 ppm组)以及DMSO(对照组)。对诱导后形成的拟胚体以及不同发育阶段的细胞进行检测,通过MTT法测定细胞的生存能力,统计有自主节律跳动的拟胚体的数量;流式细胞仪计数分析细胞分化比例;荧光定量PCR检测心肌特异性基因表达;并应用基因芯片方法初步筛选检测三氯乙烯对心肌细胞钙离子通道相关的基因表达的影响。结果:TCE的三个浓度处理组均未显示细胞毒性,但高浓度组明显抑制向心肌细胞分化,能产生自主节律搏动的拟胚体比例显著降低,同时心肌特异性标记物c Tn T表达随剂量的增加而显著降低。在具有自主节律性的拟胚体中,钙离子通路的相关基因表达受到影响。结论:推测TCE通过降低成熟心肌的比例,以及影响心肌细胞中钙离子通道相关基因表达来共同导致心脏发育异常。     

人胚胎干细胞向心肌细胞定向诱导分化

最近已有多种方案用于人胚胎干细胞向心肌细胞分化,但是分化效率相对较低。因此,有必要研究更恰当的分化方法,来加强心肌细胞分化,从而产生满足细胞移植治疗需要的大量细胞。本研究表明,早期拟胚体形成阶段使用含血清培养基对人胚胎干细胞向心肌分化具有至关重要的作用。在EB形成阶段的第5-7天,加入维生素C、二甲基亚砜和5-氮杂2′-脱氧胞苷处理,能够促进具有自发节律性收缩的心肌细胞的分化。用0.1mmol／L AA,特别是与5-aza-dC联合能诱导分化更多的搏动心肌细胞。大部分自发节律收缩的细胞团的收缩频率与成人心脏搏动频率一致,并持续至194天。     

Wnt3a诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究

目的：研究Wnt3a在诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化中的作用和原理。方法：设计不同浓度,不同成分的Wnt3a条件培养基对小鼠胚胎干细胞诱导分化,对分化细胞进行形态学鉴定,通过免疫细胞化学检测心肌肌钙蛋白-T（cTnT）的表达,通过RT．PCR检测肌球蛋白重链（ot．MHC）和肌球蛋白轻链（MLC．2v）的表达。结果：Wnt3a诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌样细胞,分化细胞具有自动收缩性,免疫细胞化学检测心肌肌钙蛋白．T（cTllT）表达阳性,RT．PCR检测肌球蛋白重链（d—MHC）和肌球蛋白轻链（MLC-2v）表达阳性。经典Wnt信号途径的抑制剂Frizzled一8／Fc,能够抑制Wnt3a的诱导分化作用。结论：Wnt3a通过经典Wnt信号途径诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

胚胎干细胞的心脏应用

心肌梗死期间死亡的心肌细胞将由没有收缩功能的疤痕组织替代,因而极可能引起心力衰竭。对治疗心衰来说,修复死亡或损伤的心肌以及改善心功能仍面临着极大挑战。干细胞移植已在近年来的实验中用于修复损失的心肌。本文总结了近期在心肌损伤动物中实施胚胎干细胞移植的实验结果,并着重介绍对这类特定细胞的研究进展。胚胎干细胞取源于早期哺乳类胚胎的胚芽细胞,属于多功能干细胞。这类细胞具有长期增殖而不分化的能力,或台色够在培养过程中分化成包括心肌细胞在内的所有特殊体细胞。由于胚胎干细胞具有极大的增殖和分化为成熟组织的能力,它们可能成为一种潜在的很有实用价值的细胞来源,可用于对病态心脏的功能心肌再生的细胞治疗。新近的研究表明,在心肌梗死动物模型中,心肌内移植胚胎干细胞或由其分化成的心肌样细胞,能导致已损伤心肌的再生,并改善心脏功能。另外,在病毒性心肌炎小鼠中,静脉输入胚胎干细胞可明显提高生存率和减轻心肌损伤。有关人类胚胎干细胞在体外分化成心肌细胞以及这些细胞的特性,近来已有报道。然而,要在临床能应用人类胚胎干细胞或由其分化成的心肌细胞来治疗晚期心脏疾病,还必须越过大量的伦理、法律和科学上的障碍。     

ISL1与PHF8相互作用促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化

近年的研究发现,在心肌细胞分化过程中,转录因子可以与表观修饰蛋白质结合进行更为精细的转录调控.作为转录因子的胰岛素基因增强子结合蛋白1（islet1, ISL1）,在心血管发育过程中发挥至关重要的作用.然而, ISL1是否能够与表观修饰蛋白质相互作用,从而发挥更为精细的调控作用,目前尚未明确.本室研究发现,ISL1在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,能够与组蛋白去甲基化酶PHD指蛋白8(PHF8)相互作用从而促进分化. 实时RT-PCR和Western 印迹的方法检测显示,ES细胞向心肌细胞分化过程中ISL1和PHF8具有相似的表达谱.通过免疫共沉淀的方法检测分化过程中ISL1与PHF8的结合,通过染色质免疫沉淀的方法对二者在ISL1下游靶基因增强子区的结合水平进行检测,利用实时RT-PCR检测二者的相互结合对心肌细胞分化的影响.结果显示,ISL1能够与PHF8相互作用,共同结合在ISL1下游靶基因Mef2c和Myocd的增强子区,协同促进ES细胞向心肌细胞的分化.本研究证实,在心肌细胞分化过程中,ISL1存在与表观修饰蛋白质PHF8的相互作用,从而进一步促进心肌细胞的分化.     

κ-阿片受体激动对高糖诱导心肌肥大的影响

目的:研究κ-阿片受体(κ-OR)激动剂U50488H在高浓度葡萄糖(25.5mmol/L)诱导的心肌细胞肥大中的作用及可能的信号转导通路。方法:以原代培养的新生大鼠心肌细胞为模型,应用25.5mmol/L的高浓度葡萄糖诱导心肌肥大,用Lowry法检测心肌细胞蛋白含量;用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;用Western蛋白印迹法测定细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平。结果:25.5mmol/L的高浓度葡萄糖使心肌细胞蛋白含量和体积明显增加,1μmol/L的U50488H能抑制高糖诱导的心肌肥大,使ERK磷酸化水平降低,与10μmol/L的ERK抑制剂U0126对心肌肥大的抑制程度相近,统计结果没有显著性差异。结论:U50488H抑制高糖诱导的心肌肥大与ERK信号有关。     

雷帕霉素促进胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 雷帕霉素是小分子mTOR抑制剂,可激活细胞自噬.本研究检测了雷帕霉素对胚胎干细胞(ES细胞)向心肌分化的影响.方法 采用拟胚体(embryoid body,EB)加抗坏血酸诱导ES细胞向心肌分化.悬浮诱导阶段添加自噬激动剂雷帕霉素或抑制剂羟氯喹,通过免疫印迹检测LC3蛋白剪切以监测细胞自噬水平,通过检测EB球的心...     

过表达miR-155抑制BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

目的:研究过表达miR-155对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响。方法:(1)用重组腺病毒Ad-BMP9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞成骨分化,定量PCR(qPCR)检测miR-155的表达,RT-PCR检测Runx2和ALP的表达。(2)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测miR-155的表达,ALP活性和染色检测早期成骨能力。(3)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,诱导分化14d茜素红S染色检测晚期成骨能力。(4)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN的表达。(5)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达。(6)qPCR和Western blot分别检测HIF1α和VEGF的mRNA表达水平和蛋白质表达水平。(7)应用荧光素酶报告基因对miR-155的靶基因进行筛选和验证。结果:在BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程中,过表达miR-155降低ALP活性及染色;减少钙盐沉积;成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN表达降低;抑制p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达;HIF1α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平减少。在对靶基因的检测中,过表达miR-155可以抑制HIF1α蛋白水平的表达,但对其mRNA水平无明显影响。结论:miR-155过表达减弱BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化,可能是通过抑制Smad/BMP信号通路发挥作用,也有可能是通过抑制靶基因HIF1α的表达来发挥作用。     

Tbx18 能使兔脂肪干细胞向心肌样细胞分化

目的:研究Tbx18是否能成功转染脂肪干细胞并使脂肪干细胞向心肌细胞分化。方法:分离培养来源于日本大耳兔腹股沟部脂肪的兔脂肪干细胞,用搭载有Tbx18的腺病毒载体转染脂肪干细胞,诱导分化后检测向心肌细胞的分化情况,同时将转染了含GFP的腺病毒组与未转染组作为对照。采用用流式细胞仪检测转染效率,采用免疫荧光法检测平滑肌肌动蛋白α-SMA,采用实时定量PCR法检测兔肌钙蛋白TNNT2的表达。结果:转染后荧光显微镜下可观察到荧光表达,且持续时间较长。流式细胞仪检测转染效率为70%左右;诱导分化后,脂肪干细胞内出现了α-SMA和TNNT2的表达。结论:Tbx18可成功转染入脂肪干细胞,且能在细胞内稳定表达;Tbx18可诱导脂肪干细胞向心肌样细胞分化。     

大麻素Ⅱ型受体通过激活心脏祖细胞促进小鼠心肌梗死后内源性的心肌再生

大麻素Ⅱ型受体(CB2受体)激活可促进干细胞(如造血干/祖细胞和神经祖细胞)的增殖.心脏祖细胞激活和增殖在心肌梗死(心梗)后心肌内源性再生和修复中发挥重要作用.为了探讨CB2受体激活在促进心梗后心肌内源性再生和修复中的作用及具体机制,将雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、心梗组、心梗+AM1241(CB2受体激动剂)组和心梗+AM1241+Wortmannin(PI3K抑制剂)组,通过结扎左冠状动脉前降支建立小鼠心梗模型.利用vevo2100小动物超声观察小鼠左室射血分数和短轴缩短率的变化;马松三色染色观察心梗后心肌纤维化水平;免疫荧光染色观察心梗周边区表达c-kit,Runx1和ki67的阳性细胞数;酶联免疫吸附测定检测血浆中MDA,TNF-α和IL-6的水平;Western blot检测p-Akt,HO-1和Nrf-2蛋白的表达变化.结果表明,与心梗组相比,AM1241干预可提高小鼠心脏左室射血分数和短轴缩短率,同时减轻心肌纤维化的程度.免疫荧光染色结果显示,心梗+AM1241组,c-kit,Runx1和ki67染色的阳性细胞数量明显高于心梗组(P0.05).此外,AM1241还可降低心梗后血浆中MDA,TNF-?和IL-6水平(P0.05).Western blot结果提示,AM1241可明显增加细胞质中p-Akt和HO-1表达(P0.05),同时促进胞核中Nrf-2的表达水平(P0.05).然而,PI3K抑制剂Wortmannin可阻断AM1241的上述作用.以上结果表明,AM1241干预可促进心梗后心肌内源性再生,改善心脏功能和心肌重塑,此作用可能是通过调节PI3K/Akt/Nrf-2信号通路实现的.     

一种新的分化心肌细胞筛选策略：稳定表达αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo融合基因的人胚胎干细胞系的建立及其向心肌细胞定向分化的鉴定

心肌梗死是威胁人类健康的重要疾病之一,胚胎干细胞来源的心肌细胞移植是目前治疗心肌梗死的研究热点. 但是由于受到分化的心肌细胞纯度的影响,限制了心肌分化的机理研究以及临床应用. 本实验构建含有心肌特异性启动子α MHC启动的灭瘟素（Blasticidin,简称Blar）抗性基因及增强绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒表达载体αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo. 应用慢病毒转染技术将慢病毒转染到人胚胎干细胞（hESCs）,胚胎干细胞特异性启动子Rex启动mCherry和neo抗性蛋白的表达. 经过G418药物筛选,建立G418和mCherry阳性的细胞系. 通过PCR及流式细胞术,进一步鉴定稳定转染的hESCs细胞系;核型分析表明,该细胞系在建立过程中仍保持细胞核型的稳定. 在诱导稳定转染的hESCs向心肌细胞分化的实验中,分化的心肌细胞表达心肌细胞特异的肌钙蛋白(cTnT),同时具有EGFP和Blasticidin药物筛选的双标记.本实验建立的这一细胞系可用于心肌细胞的纯化,为深入研究心肌发生发育的关键调控机制及临床应用奠定基础.     

胚胎干细胞定向分化为心肌细胞研究进展

胚胎干细胞在体外可分化为 3个胚层的所有组织细胞。诱导人类胚胎干细胞定向分化为心肌细胞可为心肌梗死、心肌坏死等重大心脏疾病患者实施细胞治疗 ,也可作为种子细胞 ,用于构建供器官移植用的人造心脏 ;进一步可研究心肌细胞发育分化的分子机理及更直观的用于体外筛选人类心血管药物等。对人类胚胎干细胞及其定向分化为心肌细胞分子机理的研究进展及其所面临的问题作一综述。     

大鼠双下肢骨折合并失血对心肌细胞损伤的作用及其机制

目的：探讨双下肢骨折创伤失血反应可否诱导心肌细胞发生凋亡反应,为深入研究骨折创伤后心肌损伤机制奠定基础。方法：SD大鼠20只,随机分为对照组及创伤组（n=10）,制备双下肢骨折创伤失血模型;原代心肌细胞培养复制创伤模型。ELISA检测血清IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α水平;心肌组织HE染色、Tunel试验观察心肌受损、凋亡;Western blot及RT-PCR检测心肌组织凋亡调控基因Bcl-2/Bax表达变化。结果：创伤后血清炎性因子时间依赖性改变,IL-2（8 h）、IL-6、IL-10（4 h）、TNF-α（1 h）达到峰值,随后逐步回落;心肌HE染色发现心肌细胞肿大,排列紊乱,炎细胞浸润;Tunel试验证实大量核染成棕褐色的心肌细胞,凋亡指数增加（P<0.05）;Western blot及RT-PCR检测表明,无论在体及心肌细胞培养中,促凋亡基因Bax表达上调（P<0.05）,而抑凋亡基因Bcl-2表达下调（P<0.05）。结论：大鼠双下肢骨折创伤失血反应通过诱导心肌细胞凋亡进而造成心肌损伤。     

BMP9对人肺腺癌A549细胞侵袭、迁移的影响及机制的研究

BMP9属于TGF-β超家族的成员,参与多种细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭、转移过程。以人肺腺癌细胞A549作为目的细胞,采用腺病毒体外感染方式,外源性高表达BMP9。RTPCR及Western blot检测重组细胞中BMP9的表达,通过细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测AdBMP9细胞侵袭及迁移改变,RT-PCR及Western blot检测感染BMP9腺病毒后IL-6的mRNA和蛋白表达;Western blot检测PI3K/Akt信号通路中总Akt和磷酸化Akt蛋白的表达。结果显示:与对照组细胞相比,感染BMP9腺病毒后,A549中BMP9 mRNA和蛋白表达明显升高;实验组划痕愈合率由对照的(85.4±2.1)%与(86.5±3.4)%上升至(97.4±2.6)%(P0.05);实验组穿膜细胞数由对照的(115.5±13.1)个与(123.3±14.9)个上升至(224.3±24.6)个(P0.05);与对照组细胞相比,AdBMP9组IL-6的表达上调,磷酸化Akt蛋白表达上调。该研究表明,BMP9可能通过上调IL-6的表达,激活PI3K/Akt信号通路,促进人肺腺癌A549的侵袭、迁移。