CHO/dhfr-细胞定点整合高效表达系统的建立

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k₂tPA)、扩增基因（dhfr）、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因（neo）,且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr^－细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点（Hot spot）区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统（FLP-FRT）将外源基因定点整合到Hot spot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k₂tPA的高表达,表达量达到17.1μg/10⁶cell·24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。     

CHO/dhfr-细胞定点整合高效表达系统的建立

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k2tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因(neo),且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr-细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点(Hotspot)区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统(FLP-FRT)将外源基因定点整合到Hotspot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k2tPA的高表达,表达量达到17.1μg/106cell.24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。     

CHO/dhfr-细胞定点整合高效表达系统的建立

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因（k2tPA）、扩增基因（dhfr）、重组酶识别序列（FRT）及筛选基因（neo）,且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO／dhfr^-细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点（Hotspot）区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO／dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统（FLP-FRT）将外源基因定点整合到Hotspot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k2tPA的高表达,表达量达到17．1μg／10^6cell·24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。     

利用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达人白蛋白基因的中国仓鼠卵巢细胞系

通过目的基因的随机整合方式,构建得到的CHO表达细胞系,常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域,而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象,这主要是由于位点效应所导致的。为了解决这个问题,现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组,将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上的稳定表达区域,以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定。利用该技术总共获得了2株外源基因(人白蛋白基因)定点整合细胞系; Western blot结果显示,细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性;细胞在贴壁状态下,两株细胞系在第3、12、23、35、50代,细胞每日表达的HSA质量接近,且均维持在0. 5pg cell/d;选取一株表达细胞系,经悬浮驯化后,在批次条件培养下,第1、25、50代的悬浮细胞,在摇瓶内的表达浓度均稳定在13～14mg/L。显示了将外源基因定点整合于CHO细胞基因组内的可行性;且外源基因整合在稳定表达区域后,重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性。     

克服位置效应提高外源基因在CHO细胞中稳定高效表达的策略

能够生产有功用的治疗性蛋白的一个重要前提是获得稳定的重组蛋白高表达细胞株,然而筛选一个能够持续稳定表达外源蛋白的重组细胞株是费时费力的过程。有多篇文献报道了重组蛋白细胞株表达的不稳定性。位置效应是高表达细胞株不稳定性的重要因素,克服或利用位置效应是当前获得稳定高表达重组蛋白细胞株的有效途径。为解决外源基因插入的随机性所带来的不可预知的后果,可以事先在CHO细胞基因组中筛选转录热点区域,再通过位点特异性或同源重组的方式,实现外源基因的定点整合。各种调节位置效应的DNA元件陆续被发现,可以利用它们去调控基因表达及增加细胞株的稳定性。     

ΦC31整合酶介导猪基因组定点修饰的探讨

高效与特异的基因组定点修饰是基因工程动物研究的前沿与难点.链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能介导含attB位点的外源基因定点整合于多种真核生物基因组的假attP位点,可维持外源基因的正常结构及高效表达.本文探讨ΦC31整合酶介导外源基因在猪基因组内定点整合的分子基础.构建含attB位点的报告载体pEGFP-N1-attB,与ΦC31整合酶表达载体pCMV-INT共转染猪肾PK15细胞,G418筛选获得单克隆细胞系.实时荧光定量PCR筛选出单拷贝整合的转基因细胞系.TAIL-PCR鉴定出1个猪基因组假attP位点,位于猪1号染色体,watson链,坐标114220087-114220126,命名为pig-attP-1.测序结果显示,pEGFP-N1-attB在attB位点处断开插入到pig-attP-1.用荧光计测定细胞培养基上清EGFP含量发现,该转基因细胞系EGFP的表达水平是本底的50倍(13500 AU vs.280 AU),表明pig-attP-1是利于外源基因高效表达的"友好位点".该研究不仅为实现外源基因在猪基因组内的定点整合提供了新策略,也为创制基因工程猪、建立动物生物反应器等研究注入了新思路.     

应用接头PCR的方法扩增假attP位点

φC31整合酶可高效介导外源基因特异、稳定地与哺乳动物基因组发生重组反应.基因组中被整合的住点为假attP位点.运用接头PCR的方法对φC31整合酶介导的含有attB序列及表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体在牛基因组中的一个新的特异整合位点(假attP位点)进行扩增.并且显示接头PCR技术在克隆与已知序列相邻的未知旁侧序列上其具有高效、特异、灵敏等特点.     

重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的影响因素

高效表达重组蛋白 ,对于生物制药意义重大。大多数药用蛋白是糖蛋白 ,中国仓鼠卵巢细胞 (Chinesehamsterovarycell,CHO)是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多 ,从CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等方面对CHO高效表达加以阐述 ,同时提出存在的问题和未来的发展方向。     

CHO细胞基因组NW-003614092.1内稳定表达位点的发现*

目的:获得中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)内稳定表达位点信息,为构建重组蛋白CHO稳定表达株、缩短研发时间线提供信息明确的稳定位点。方法:对慢病毒随机整合Zsgreen1基因的具有潜在稳定表达位点的CHO-K1-1d2细胞株进行连续传代培养,验证表达稳定性;通过染色体步移分析慢病毒载体整合位点,并利用CRISPR/Cas9技术验证位点的可编辑性。结果:CHO-K1-1d2细胞在连续贴壁培养20代、悬浮培养50代过程中,能够100 %发绿色荧光,且荧光强度稳定,能够稳定表达Zsgreen1蛋白;染色体步移分析测序结果表明,CHO-K1-1d2细胞中慢病毒载体整合于CHO细胞基因组NW-003614092.1上第1 159 463与1 159 467碱基间;共转染sgRNA与Cas9质粒后,测序结果表明,该位点可被CRISPR/Cas9技术编辑。结论:CHO细胞基因组NW-003614092.1内存在一个信息明确的、能够被CRISPR/Cas9技术编辑的稳定表达位点。     

重组酶介导的定点整合及在构建重组CHO细胞中的应用

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)是生产治疗性重组蛋白最常用的细胞。随机整合(random integration,RI)工艺是目前构建重组CHO细胞株的主要策略,由于CHO细胞基因组缺乏稳定性,为得到产量高、品质好且适应特定工艺的细胞株,通常需要1~2轮高通量筛选,不仅工作量大、耗时长且批次稳定性差。定点整合(site-specific integration,SSI)基因编辑技术将外源基因整合至细胞基因组的特定位点,经一轮筛选得到稳定、高产且适应特定生产工艺的细胞株,从而缩短细胞株构建周期。近年来,不断有将定点整合策略应用于构建重组CHO细胞株的报道。基因编辑技术的发展是实现细胞外源基因定点整合工艺的基础,常用的基因编辑技术包括核酸酶技术、转座子技术和重组酶技术。比较这三种基因编辑技术在构建流程、整合效率和专利等方面的不同特点,重点讨论重组酶介导的定点整合及其在CHO细胞株构建中的应用。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.