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RNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统由单链引导RNA(sgRNA)与核酸酶Cas9构成。在细胞内,sgRNA能够按照碱基互补配对的原则引导Cas9与靶点结合,由Cas9切割目标DNA,造成双链DNA断裂(double stranded break, DSB)。在随后的DNA修复过程中,细胞主要进行非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或在有修复模板存在的情况下进行重组修复(homology directed repair, HDR)。如果将CRISPR/Cas9系统以及修复模板通过显微注射的方式导入大鼠的胚胎内,就能借助细胞的修复机制实现大鼠胚胎的基因编辑,由此构建各种基因修饰大鼠模型。本文详细介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠模型的具体操作步骤,以期为相关领域的科研人员提供一种大鼠基因修饰模型的构建方法。 相似文献
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规律性成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的发现和工程技术对生命科学的发展带来巨大的推动作用。RNA引导的Cas(CRISPR-associated)酶已被用作操纵细胞、动物和植物基因组的工具。这加速了基础研究的步伐,并使其在临床和农业上的应用成为可能。CRISPR/Cas9对在实验系统中进行的功能基因组学的研究有重大影响。CRISPR/Cas9系统自发现以来,因其操作便捷、成本低、特异性高、可同时打靶任意数量基因等优点而被广泛应用。经过近几年研究发现,Cas9变异体(Cas12a、Cas13)有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制,Cas12a极大地扩展了基因编辑靶位点的选择范围,同时其介导的多基因编辑具有明显的优势;Cas13等蛋白能特异性结合和编辑RNA,开启了转录组研究的新篇章。本文主要就CRISPR/Cas的研究背景以及Cas9、Cas12a和Cas13系统研究进展和应用进行综述,并对其应用前景和发展方向进行了展望。 相似文献
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基因编辑技术是通过核酸内切酶对基因组DNA进行定向改造的技术,可以实现对特定DNA碱基的缺失、替换等,常用的四种基因编辑工具分别是:巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9系统.其中CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术具有组成简单、特异性好、切割效率高的优点.该文对... 相似文献
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CRISPR/Cas9基因组编辑技术的研究进展及其应用 总被引:1,自引:0,他引:1
随着测序技术的不断进步,获得了越来越多物种的全基因组序列。面对这些海量的基因组数据,基因定点编辑技术是高效捕获目标基因、迅速获得基因功能和应用信息的重要研究手段。CRISPR/Cas9是目前最有效的一种基因定点编辑技术。CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)是广泛存在于细菌及古生菌中的,由细菌体长期进化而形成,能够降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。因此,对CRISPR/Cas9系统的发展、应用,以其在相关研究中的应用前景进行阐述显得尤为必要。 相似文献
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拟利用CRISPR/Cas9技术建立编辑FGF5基因的绒山羊细胞株。在FGF5基因的第一外显子设计靶点并合成gRNA靶点引物,构建2个编辑FGF5基因的Cas/gRNA真核表达质粒载体。电穿孔法转染绒山羊成纤维细胞后T7核酸内切酶(T7E1)检测载体活性,选择活性最高的载体转染细胞,单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。经测序分析共获得20个FGF5基因敲除细胞株(包括FGF5+/-和FGF5-/-),总突变率为14.81%。双敲除突变细胞株可作为供体细胞进行重构胚构建,为创造高产绒性状的FGF5基因编辑绒山羊奠定基础。 相似文献
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微藻由于在医药、食品、可再生燃料和化学原料等方面的潜力,受到了研究者越来越多的关注和青睐。然而,合适基因编辑方法和转化工具的缺乏,使得微藻基因工程的进展还相对比较缓慢。随着分子生物和基因编辑技术的发展,CRISPR 技术凭借简便、特异和高效的优势,逐渐成为探讨基因功能、提高植物育种和增加代谢物产物等研究的有力手段。基于此,本文综述了CRISPR/Cas 的2 种主要类型,重点论述了其在微藻领域中的应用进展,并总结了CRISPR 技术在微藻应用中所存在的问题,期望为以后的研究提供启发和参考。 相似文献
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目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对LHX9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼LHX9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对LHX9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现LHX9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼LHX9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的LHX9基因进行编辑,发现LHX9基因突变导致dph6的的斑马鱼原始生殖细胞增殖和迁移受到影响。结论:基于4条sgRNA注射的CRISPR/Cas9技术,可以快速地产生具有突变表型的G0斑马鱼,具有应用潜力。LHX9基因敲除导致原始生殖细胞的发育和迁移受到影响,提示该基因参与了斑马鱼早期性腺的发育。 相似文献
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目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,实现EGFP基因在CHO细胞ACTB基因座位置定点整合和表达,建立基于CRISPR/Cas9技术的外源基因定点整合和表达技术。方法:根据CHO细胞β-actin(ACTB)基因起始密码子区基因序列,设计相应CRISPR/Cas9系统,同时构建含有ACTB同源臂和EGFP基因的同源供体载体(donor vector),通过脂质体转染法同时转染CRISPR/Cas9和供体载体,流式分选EGFP阳性细胞,分析基因编辑技术在EGFP基因定点整合和表达方面的可行性。结果:构建了能有效切割CHO细胞ACTB基因的CRISPR/Cas9系统,筛选到EGFP定点整合至ACTB基因座并有效表达的细胞,ACTB基因缺失后由于γ-actin代偿性表达增强,ACTB缺失细胞形态和生长未受影响。结论:单纯依靠基因编辑技术可以实现1 kb以内的基因同源置换,但效率较低,如实现更大片段的外源基因置换,需借助其它实验技术。 相似文献
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近日,宾夕法尼亚州立大学杨亦农(Yinong Yang)教授团队在a BIOTECH期刊在线发表题为"Efficient expression of multiple guide RNAs for CRISPR/Cas genome editing"的综述。总结了CRISPR/Cas基因编辑技术中引导RNA (gRNA)的表达策略,介绍了多重基因编辑中同时表达多个引导RNA的方法和技巧,为CRISPR/Cas技术的开发和应用提供了参考。 相似文献
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CRISPR/Cas基因编辑技术在植物基因功能研究和作物遗传改良方面具有重要应用价值,其主要依赖gRNA引导核酸内切酶在目标基因组位置产生双链断裂(DSBs),DSBs在通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HDR)方式进行修复时,会引起靶标位置核苷酸序列的缺失、插入或者替换,从而实现基因编辑。介绍了CRISPR/Cas基因编辑技术的作用机理及发展趋势,并对CRISPR/Cas技术在主要粮食及经济作物育种中的应用进展进行了总结,以期为农作物育种提供有益的参考。 相似文献
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CRISPR/Cas技术是一项新兴的基因编辑技术,它利用与目标序列互补的向导RNA(sg RNA)引导Cas酶定点切割DNA。由于该技术操作简便、要求低,已成为近几年最受关注的基因编辑技术。而随着该技术的广泛使用和人们对CRISPR/Cas系统了解的不断深入,对该技术优与劣的争论也不断升温。本文就该技术的起源、CRISPR/Cas系统的工作原理,以及目前的主流应用和成果进行了介绍,希望能够帮助人们对CRISPR/Cas技术有一个更全面的了解。 相似文献
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