苦荞多肽的纯化、结构与体外抗氧化活性研究CSCD

为了探究苦荞多肽粗提液抗氧化活性的主要来源,需要进一步对苦荞多肽进行分离纯化,通过结构鉴定来分析抗氧化活性与多肽结构之间的关系。该研究以苦荞功能提取物废渣为原料提取苦荞粗蛋白辅以植物乳杆菌发酵法制备苦荞多肽,采用大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶、液相色谱对苦荞多肽粗提液进行分离纯化,并以抗氧化活性为指标,筛选抗氧化活性较强的组分,利用液相色谱-质谱联用技术鉴定抗氧化多肽结构。结果表明,纯度不同的苦荞多肽抗氧化能力也不同,经过Sephadex G-15葡聚糖凝胶分离纯化得到的T-3组分ABTS和DPPH自由基清除能力最优,清除率分别为96%、94%。纯化后苦荞多肽的抗氧化活性显著高于粗提液(P<0.05),但是抗氧化活性并没有完全与苦荞多肽纯度呈正相关,通过液相色谱进一步分离纯化T-3组分后得到的组分T-3-1,苦荞多肽纯度虽然达到了98%,但是对DPPH和ABTS抑制率不再增强,反而稍有下降,抑制率分别为89%和90%。由质谱鉴定结果得到,主要抗氧化肽的氨基酸序列为苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸Phe-Pro-Tyr(FPY)和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸Tyr-Leu-Pro-Phe(YLPF)。研究结果以期为苦荞多肽的进一步开发利用提供一定的理论基础。     

银杏内生真菌Aspergillus oryzae YX-5抗肿瘤活性物质的分离与鉴定

【背景】植物内生真菌是天然活性物质的重要来源。【目的】对一株具有抗肿瘤活性的银杏内生真菌米曲霉Aspergillus oryzae YX-5进行活性物质的分离与鉴定。【方法】将该菌株发酵培养后,发酵液经乙酸乙酯萃取,采用减压柱层析、葡聚糖凝胶柱层析和高效液相色谱分析,从其代谢产物中分离活性化合物,在分离过程中以MTT法跟踪检测分离到的各组分及纯化合物的抗肿瘤活性。【结果】从菌株YX-5的发酵产物中分离纯化得到4个化合物。经核磁共振和高分辨质谱分析,将其分别鉴定为羟基曲霉酸(1)、环(4-羟脯氨酸-苯丙氨酸)(2)、环(亮氨酸-苯丙氨酸)(3)和环(丙氨酸-苯丙氨酸)(4)。其中羟基曲霉酸对人宫颈癌HeLa细胞具有显著的细胞毒活性,其IC_(50)为1.07μg/mL。【结论】报道羟基曲霉酸在抗肿瘤方面的活性,表明米曲霉及羟基曲霉酸在抗肿瘤天然产物开发中具有一定的应用潜力。     

草菇子实体多肽提取工艺及其抗氧化活性

为了优化草菇子实体多肽的提取工艺和探究其抗氧化活性,以草菇子实体为原料,采用酶解法提取草菇子实体多肽,通过单因素试验得出最佳的酶解工艺,并使用Box-Behnken设计试验组合。结果表明：草菇子实体提取多肽的最佳工艺为料液比1:52 (g/mL)、加酶量7 200 U/g、酶解温度43 ℃,此工艺条件下的多肽得率为67.76%。从1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力、铁离子还原能力、超氧阴离子自由基清除能力和羟自由基清除能力4个方面研究其体外抗氧化能力,结果表明,草菇子实体多肽对DPPH自由基清除率为74.11%,超氧阴离子自由基和羟自由基清除率分别在69.64%和91.83%达到稳定,草菇子实体多肽还具有一定的还原力,说明草菇子实体多肽可以作为优质抗氧化肽的良好来源。该研究为草菇多肽的高效制备和抗氧化肽等高附加值产品的研发提供理论依据。     

蒺藜内生真菌发酵液抗菌及抗肿瘤活性初步研究

【目的】筛选出具有抗菌和抗肿瘤活性的蒺藜内生真菌。【方法】采用牛津杯法、稻瘟菌模型及肿瘤细胞模型评价蒺藜内生真菌PDB和察氏培养基发酵产物的抗菌活性和肿瘤细胞毒性。【结果】PDB培养基发酵液和察氏培养基发酵液抑菌圈直径大于10 mm的菌株分别占总菌株数的19.05%和23.81%。PDB培养基发酵液和察氏培养基发酵液对稻瘟菌的最小抑制浓度(MIC)低于10%的菌株分别占总菌株数的19.05%和47.61%。对肿瘤细胞抑制率高于50%的PDB发酵产物占PDB发酵产物总数的52.38%, 而对肿瘤细胞抑制率高于50%的察氏发酵产物占察氏发酵产物总数的28.57%。【结论】部分蒺藜内生真菌的发酵产物具有抗菌和抗肿瘤活性。     

一株红茄苳内生烟曲霉菌的分离鉴定及其发酵产物抗氧化活性

【目的】红树林内生真菌生长于特殊的生境,有些菌株能分泌出结构新颖和具有生物活性的物质。从红树林植物红茄苳(Rhizophora mucronata)中分离获得一株内生真菌HQD24,对其进行生物学鉴定和抗氧化活性评价。【方法】综合运用形态结构及ITS r DNA序列分析,HQD24被鉴定为曲霉属(Aspergillus)的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。采用抗氧化多活性模型,2-2′二苯基-1-三硝基苯肼(DPPH)自由基测定法、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基测定法、超氧自由基测定法、还原Fe~(3+)能力、螯合Fe~(2+)能力对HQD24麦麸发酵提取物的石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物进行抗氧化活性评价。【结果】经抗氧化活性实验发现不同有机溶剂萃取成分都具有清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和还原Fe~(3+)、螯合Fe~(2+)的能力,尤其是清除ABTS自由基和超氧自由基,抗氧化活性的能力都随着浓度的增高而增强。当不同有机溶剂萃取粗提物浓度为1.5 g/L时,二氯甲烷萃取物清除ABTS自由基率为71.92%,正丁醇萃取物清除超氧自由基率为62.36%,综合评价,HQD24的发酵产物中具有抗氧化活性的物质主要分布于二氯甲烷萃取粗提物和正丁醇萃取粗提物,其次分布于乙酸乙酯萃取粗提物,石油醚萃取粗提物中抗氧化活性物质含量最少。【结论】研究结果预示红树林内生烟曲霉菌是产生抗氧化活性物质的重要资源,HQD24菌株可以作为进一步实验研究的对象。     

牦牛骨抗氧化肽的分离纯化及鉴定

为了分离纯化及鉴定牦牛骨胶原多肽,以得到具有DPPH自由基清除率的抗氧化肽。合成抗氧化肽,验证其对DPPH自由基清除率。牦牛骨胶原多肽经陶瓷羟基磷灰石柱层析和C18反相高效液相色谱层析后得到组分F11。当其质量浓度为1 mg/mL时,对DPPH自由基清除率为34.45%。用反相高效液相色谱-质谱联用对F11组分进行序列测定,得到氨基酸序列为GPAGPPGPIGNVGAPGPK和GKSGDRGETGPAGP AGPIGPVGAR的抗氧化肽,分子量分别为1 570.810 3 Da和2 160.104 Da。合成抗氧化多肽GPAGPPGPIGN VGAPGPK和GKSGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR,当其质量浓度为1 mg/mL时,对DPPH自由基清除率分别为16.59%和35.17%。本研究分离鉴定出牦牛骨抗氧化肽,牦牛骨可能成为一种潜在的抗氧化剂。     

鲮鱼皮胶原肽的制备及其抗氧化活性的检测

为了以细菌胞外蛋白酶酶解低值蛋白资源制备抗氧化活性肽以及挖掘新型蛋白酶,采用液体发酵培养的方法对假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.SHK1-2进行发酵产酶,获得胞外蛋白酶粗酶液用于酶解热水法提取的鲮鱼胶原蛋白,通过超滤、sephadex LH-20分子筛层析获得具有DPPH自由基清除能力(35.6%±7%)、氧自由基清除能力(Oxygen radical absorbance capacity,ORAC)及DNA氧化损伤抑制活性的小分子肽,液相色谱质谱联用鉴定该活性肽分子量为776.2 Da,预测氨基酸序列为Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His。ORAC检测验证了人工合成的多肽同样具有抗氧化活性。研究表明细菌胞外蛋白酶在低值资源高值化中具有一定的应用前景,对于新型蛋白酶及其应用的挖掘具有一定的参考意义。     

纳豆多糖发酵工艺的优化及清除自由基研究

考察了纳豆菌接种量、料液比、发酵温度及发酵时间对纳豆菌发酵豆粕产生的纳豆多糖得率的影响,进行了响应面设计实验,得出最佳发酵工艺参数;探究了纳豆多糖的抗氧化活性,并与维生素C进行比较。实验结果表明:接种量为0. 6%,料液比为1∶3,发酵温度40℃,发酵时间48 h,在此工艺条件下水溶性纳豆多糖得率最高为4. 371%。纳豆多糖浓度为1. 5 mg/mL时,对羟基自由基的清除率是50. 07%,对超氧阴离子自由基的清除率达95. 79%,对DPPH自由基的清除率为16. 35%。     

一株盐湖芽孢杆菌LG的鉴定及其抗金黄色葡萄球菌活性研究

【目的】从运城盐湖中分离获得一株耐盐细菌LG,对其进行分类鉴定及抗菌特性研究。【方法】利用16S rRNA基因序列分析对菌株进行分类鉴定。以金黄色葡萄球菌为指示菌,采用杯碟法对菌株LG发酵上清液进行抗菌活性检测,利用扫描电镜和透射电镜观察其抗菌效果。研究不同因素对上清液抗菌活性的影响,并采用PCR技术对菌株基因组进行功能基因筛查。【结果】系统发育分析表明该菌为Bacillus属成员,在0–25%的NaCl浓度范围内生长良好,为耐盐细菌。电镜观察发现,菌株LG发酵上清液处理金黄色葡萄球菌可导致细胞结构明显出现异常,细胞质泄漏。抗菌稳定性研究表明,菌株LG发酵上清液活性稳定,表现出了良好的对紫外光、温度、pH和NaCl的耐受性。采用特异性引物,通过PCR筛查发现菌株LG基因组中含有聚酮合酶(PKS I)基因和非核糖体肽合成酶(NRPS)基因,表明该菌具有产多种代谢产物的潜力。【结论】极端环境中的微生物资源可作为抗菌活性物质的潜在新来源。     

具有抗哈维氏弧菌活性共生真菌HLZ-3菌株的筛选、鉴定及其培养条件

【背景】目前,海水养殖业中主要利用抗生素来防治哈维氏弧菌等病原菌,但抗生素的长期使用或滥用会对环境和人体健康带来危害,因此既环保又有效的生物防治方法具有广阔的应用前景。【目的】从海水产品共生微生物中筛选具有抗菌活性的菌株,对活性菌株进行鉴定并确定其合成抗菌活性物质的培养条件。【方法】利用沙氏和2216E培养基,以稀释涂布平板法从海水养殖动物中分离真菌和细菌;利用牛津杯法测定微生物发酵液抗水产病原哈维氏弧菌的活性;通过菌株的培养特征、形态特征和ITS序列分析对抗菌活性菌株进行鉴定;通过筛选发酵培养基的种类及盐度确定培养条件。【结果】从海蚌、白虾、海蛎子等9种样品中分离出微生物52株,其中真菌30株、细菌22株;筛选得到2株具有抗哈维氏弧菌活性的真菌菌株;其中一株活性菌株HLZ-3被鉴定为塔宾曲霉;菌株HLZ-3合成抗菌活性物质的培养条件为4%NaCl的大米培养基,28°C静置培养2周。【结论】实验结果为进一步分离纯化菌株HLZ-3所产抗菌活性次生代谢产物提供了基础。     

西藏仲巴五彩沙漠放线菌资源勘探及生物活性筛选

【背景】细菌耐药性问题日益严峻,新抗生素的研发速度远远落后于临床需要,从特殊生境中挖掘微生物药物资源有望解决以上问题。【目的】勘探西藏仲巴五彩沙漠土壤放线菌多样性并进行生物活性筛选,为发现药用放线菌资源、开发新型抗生素奠定基础。【方法】采用8种分离培养基,通过平板稀释涂布法分离放线菌;根据分离菌株的16S r RNA基因序列同源性分析放线菌多样性;采用PCR技术对分离的放线菌菌株进行II型聚酮合酶(PKS-II)酮缩酶结构域KS、非核糖体多肽合成酶(NRPS)腺苷酸化结构域A、安莎类抗生素生物合成前体3-氨基-5-羟基-苯甲酸合酶(AHBA)保守区、黄素腺嘌呤二核苷酸卤化酶(Halo)保守区抗生素生物合成基因检测;对生物合成基因检测阳性的菌株进行液体发酵,发酵液经乙酸乙酯萃取、菌体经丙酮浸提,获得提取浓缩物样品进行抑菌活性和抗氧化活性筛选。【结果】从4份土样中分离纯化到231株放线菌,分布于7个属,其中链霉菌为优势菌属。68株放线菌的生物合成基因分析显示至少具有1种生物合成基因簇,其中6株同时具有4种生物合成基因簇;进一步的抑菌活性检测显示所有检测的菌株至少表现为对1株检定菌具有抑菌活性,其中8株具有广谱抗菌活性;抗氧化活性筛选结果为13株显示总抗氧化能力阳性,10株具有较好的羟自由基清除能力,3株显示较强的氧自由基清除能力。【结论】西藏仲巴五彩沙漠土壤中含有较丰富的放线菌药用资源,具有从中发现放线菌新菌种和开发新抗生素的潜力。     

泥鳅抗菌肽在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性检测

【背景】泥鳅抗菌肽Misgurin是泥鳅非特异性免疫防御系统的重要组成部分,具有广谱和较强的抗菌能力,所以获得大量抗菌肽是很有必要的。【目的】为了实现高效表达泥鳅抗菌肽Misgurin。【方法】将泥鳅抗菌肽的目的基因与p PIC9K表达载体连接,构建重组表达质粒p PIC9K-misgurin,Sal I酶切线性化,再通过电击法将其整合到毕赤酵母SMD1168染色体上。在MD固体培养基挑选阳性克隆子到MD液体培养基中,30°C、200 r/min摇瓶培养96 h,转接到BMMY液体培养基进行诱导表达,每隔24 h加入5%的甲醇。通过比较抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的大小,筛选出活性较高的菌株p PIC9K-misgurin-22。将该菌株在100 L的发酵罐中诱导表达,48 h后进行活性检测。【结果】经Tricine-SDS-PAGE蛋白胶检测和质谱分析鉴定,p PIC9K-misgurin-22菌株诱导表达的活性物质为抗菌肽Misgurin。发酵罐发酵48 h相对于摇瓶发酵48 h,抗大肠杆菌的生物效价提高了1.47倍,抗金黄色葡萄球菌的生物效价提高了1.43倍;抗菌肽Misgurin对鲍曼不动杆菌、沙门氏菌有较弱的抗菌活性,对致病菌产气荚膜梭菌和益生菌如枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、乳酸菌没有抗菌活性,无明显溶血活性;当温度达到90°C时发酵液的抗菌活性明显减弱,调发酵液的p H值在1.0-12.0之间都有抗菌活性;加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K后抗菌活性减弱。【结论】获得了一株在毕赤酵母中表达量较高、有工业化生产潜力的产抗菌肽Misgurin的菌株。     

棘孢曲霉固态发酵柚皮产柚苷酶的条件优化

【目的】以柚皮为原料,优化棘孢曲霉利用柑橘加工副产物固态发酵柚苷酶的条件。【方法】采用高效液相色谱法检测酶活力,通过单因素试验考察固水比、装样量、接种量、温度对柚苷酶发酵的影响,用正交试验优化发酵条件。【结果】单因素试验结果的显著性分析表明培养基的固水比、装样量和培养温度对柚苷酶产量有显著性影响,而接种量影响不显著;经正交试验确定的优化条件是：固水比1:1 (质量体积比),装样量5 g/250 mL三角瓶,温度为30 °C,接种1 mL孢子悬浮液,发酵8 d。在此优化条件下,柚苷酶酶活力为8.19 IU/g干物质,比初始培养基产柚苷酶活力提高7.38倍。【结论】通过对固水比、装样量和发酵温度进行优化,大幅度提高了棘孢曲霉固态发酵柑橘加工副产物的柚苷酶产量,为柚苷酶的生产提供了一种高产发酵工艺。     

分离自茯砖茶的真菌菌株MJAU EC021的鉴定及培养过程中生理特性

【目的】从茯砖茶样中分离纯化得到生长优势菌株,研究其液体培养时的生理生化特性,为茯砖茶实际生产提供依据。【方法】用PDA平板稀释涂布法从茯砖茶中分离纯化菌株。采用常规真菌发酵培养方法,单因素筛选其培养条件,再利用响应面法优化最优培养条件,测定冠突散囊菌发酵液中还原糖、多酚、胞外酶酶活及抗氧化的能力。【结果】利用形态学与ITS序列分析鉴定优势菌株MJAU EC021为冠突散囊菌Eurotium cristatum;最优的培养条件:转速187 r/min,培养时间10 d,培养温度28°C,冠突散囊菌生物量为21.52 g/L。冠突散囊菌发酵培养过程中4种胞外酶活性均在第10天时达到最大值,第9天时胞外多酚含量达到峰值为0.588 g GAE(没食子酸)/m L;发酵液对1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、羟基自由基的清除率达到最大值分别是90%、94%。【结论】真菌菌株MJAU EC021是株冠突散囊菌E.cristatum,发酵液具有较好的抗氧化能力,是潜在的抗氧化添加剂。     

利用天然纤维废弃物发酵生产L-乳酸的研究

为了降低L-乳酸的生产成本,更好的实现生物质秸秆的资源化,利用天然纤维素依次接种经离子注入诱变处理的木聚糖酶高产菌黑曲霉P602和米根霉RL6041高产菌进行固、液体二次发酵的方法,将其转化成用于工业生产的L-乳酸。结果表明:本实验条件下,未经过任何化学预处理的秸秆等物质接种黑曲霉P602进行固体发酵,产生的木聚糖酶活力为6 320 IU/g干(培养)基,纤维素酶活力为29 IU/g干基;加入100 mL水浸提后,产生的还原糖浓度为14.07 g/L,纤维物质糖化率为79.45%。取滤液接入米根霉RL6041进行液体发酵后,生成乳酸的量为7 g/L,糖酸转化率为47.6%,以(NH4)2SO4作为氮源时,最佳氮源浓度为3 g/L。     

青稞酒发酵过程中的风味功能微生物及其风味代谢特征解析

[背景]青稞酒是一个多菌种固态发酵的产物,解析发酵过程中重要的功能微生物及其代谢特征对调控青稞酒发酵具有重要作用。[目的]揭示青稞酒发酵过程中的风味功能微生物并解析其风味代谢特征。[方法]基于高通量测序技术揭示青稞酒发酵过程中的微生物群落多样性和组成;采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱技术跟踪酒醅的风味信息;通过微生物属与风味物质的关联分析揭示青稞酒发酵过程中风味功能微生物菌群,并采用蒙特卡洛检验分析进一步揭示发酵过程理化因子对风味功能微生物菌群的影响;于实验室环境下重构6株微生物发酵体系,以揭示其风味代谢特征。[结果]青稞酒发酵过程中9个真菌属和8个细菌属(相对丰度>1%)占据优势,其中Aspergillus、Komagataella、Lactobacillus、Pichia、Saccharomyces和Weissella是青稞酒发酵过程主要风味功能微生物;发酵过程中还原糖(r2=0.946 9,P=0.013 2)和酸度(r2=0.847 6,P=0.048 6)是驱动风味功能微生物菌群演替的关键因子;6株菌的组合发酵实验揭示了体外系统与原位系统具有相同的微生物演替现象与相...     

Solubilisation and mineralisation of [14C]lignocellulose from wheat straw by Streptomyces cyaneus CECT 3335 during growth in solid-state fermentation

Nine Streptomyces strains were screened for their ability to solubilise and mineralise ¹⁴C-labelled lignin during growth in solid-state fermentation. Streptomyces viridosporus was confirmed as an active lignin-degrading organism along with a new isolate, Streptomyces sp. UAH 15, further classified as Streptomyces cyaneus CECT 3335. This organism was able to solubilise and mineralise the [¹⁴C]lignin fraction of lignocellulose (44.96 ± 1.77% and 3.41 ± 0.48% respectively) after 21 days of incubation. Cell-free filtrates from Streptomyces sp. grown in solid-state fermentation were capable of solubilising up to 20% of the [¹⁴C]lignin after 2 days incubation, with most of the product detected in the acid-soluble rather than in the water-soluble fraction. Identification of the extracellular enzymes produced during growth of S. cyaneus CECT 3335 revealed that extracellular peroxidase and phenol oxidase activities were present, with the activity of phenol oxidase being 100 times greater than peroxidase activity. The activity of these two enzymes was found to correlate with both solubilisation and mineralisation rates. This is the first report of phenol oxidase activity produced by a Streptomyces strain during growth in solid-state fermentation. A role for the enzyme in the solubilisation and mineralisation of lignocellulose by S. cyaneus is suggested. Received: 12 May 1997 / Accepted: 19 May 1997     

In vitro antioxidant activity of liquor from fermented shrimp biowaste

Shrimp waste was fermented using lactic culture and the separated fermented liquor was lyophilized. In vitro antioxidant activities of the lyophilized powder were evaluated with respect scavenging of different radicals and quenching of generated singlet oxygen. The sample showed strong radical scavenging and singlet oxygen quenching in a dose dependent manner (p<0.001). The sample exhibited 40% scavenging of DPPH radical at 1.0mg/ml concentration while the ABTS radical scavenging was 95% even at 0.5mg/ml concentrations. Hydroxyl radical scavenging activity as measured by chemiluminescence technique showed 80% scavenging and peroxyl radical scavenging was 65% at 1.0mg/ml concentration. The singlet oxygen quenching ability of the powder was 68.3% at 1.0mg/ml concentration. The sample was found to contain low molecular weight proteins. The formation of peptides and amino acids during hydrolysis of shrimp waste protein during fermentation is expected to be responsible for the antioxidant activity. In addition as the product also contains carotenoids, it can be used as an ingredient in aquaculture feed formulations for beneficial effects.