花生△12脂肪酸脱氢酶基因高效表达载体构建与原核表达

花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一,其种子中富含油酸和亚油酸。△^12脂肪酸脱氢酶（FAD2）是亚油酸合成的关键酶,催化油酸（18：1）在△^12位上脱氢生成亚油酸（18：2）,但由于△^12脂肪酸脱氢酶本身的特性,目前还没有有效的方法将其纯化并在蛋白水平作进一步的研究,尚需对其结构和功能之间以及表达调控进行更深入全面的研究。本文利用从花生中克隆的△^12脂肪酸脱氢酶基因（GenBank接受号为AY1006）构建高效表达载体,把花生△^12脂肪酸脱氢酶基因全长序列插入到大肠杆菌高效表达载体pRSETB中,构建了pRSET／HO-A融合表达载体,并转化到大肠杆菌表达菌BL21（DE3）pLysS中,在IPTG诱导下,pRSET／HO-A融合表达载体在BL21（DE3）pLysS菌株中高效表达了△^12脂肪酸脱氢酶。利用Clon-Tech蛋白纯化Kit进一步分离了目的蛋白,同时加入外源性底物油酸在20℃温育6h后,进行脂肪酸甲酯化处理,通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,所编码的酶具有△^12脂肪酸脱氢酶的活性,能将外源性的底物油酸转化为亚油酸,转化率为11．8％。花生△^12脂肪酸脱氢酶基因的原核表达目前国内外还未见报导,本实验为其进一步的大量纯化和结构功能分析奠定了基础。     

Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达

把高山被孢霉 (Mortierellaalpina)和深黄被孢霉 (Mortierellaisabellina)的Δ1 2 脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET2 1a中 ,获得重组表达载体pMACL1 2和pMI CL1 2 ,并用氯化钙方法将重组表达载体转化到大肠杆菌BL2 1 (DE3)中。筛选阳性克隆进行培养 ,然后分离其细胞膜蛋白 ,并构建体外表达体系 ,同时加入外源性底物油酸进行表达。经气相色谱 (GC)分析表明 ,分别有 1 7 87%和 1 7 60 %的油酸转化为亚油酸     

少根根霉Δ_-~6脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达(英文)

Δ6- 脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ6- 脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16∶1、C17∶1、C18∶1、亚油酸和α- 亚麻酸在Δ6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的功能。     

花生油酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的高效表达

将克隆的油酸脱氢酶基因(AF900663)亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES6/CT,从大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYES/HO-A,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScI中,经半乳糖诱导后,收集菌体,用气相色谱质谱(GC-MS)仪分析转化酵母的脂肪酸色谱的结果表明,HO-A所编码的酶具有油酸脱氢酶活性,能将酵母内源性油酸转化为亚油酸,油酸脱氢酶的表达量为15.6%,高于已有的报道。     

Δ~6-脂肪酸脱氢酶的分子生物学研究进展

包括γ_亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸由于在人类健康中的重要作用而成为有价值的产品 ,目前市场上对γ_亚麻酸的需求持续增长 ,然而当前来源难以满足市场的需求 ,寻找合适的替代来源将有助于解决这一问题。Δ6 _脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶 ,这里从Δ6 _脂肪酸脱氢酶的基因克隆、结构和功能的研究、系统进化和基因工程应用等方面探讨了Δ6 _脂肪酸脱氢酶的研究进展。     

高山被孢霉ATCC16266Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYMAD6 ,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了 31 6 %的γ 亚麻酸。这是迄今为止 ,国内外Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

“自我剪切”2A肽介导的Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶以及过氧化氢酶在转基因小鼠肌肉表达研究

哺乳动物因为缺乏Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶,不能自身合成必需的多不饱和脂肪酸．目前,通过转基因技术在哺乳动物体内表达ω-3脂肪酸脱氢酶,能将长链的n-6多不饱和脂肪酸转化成n-3多不饱和脂肪酸,造成体内长链的n-6多不饱和脂肪酸含量显著减低．本研究通过自我剪切2A肽介导Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶(FAT-2和FAT-1)以及人过氧化氢酶(human catalase,hCAT)在小鼠的肌肉同时表达．结果表明,转基因小鼠肌肉中长链n-3多不饱和脂肪酸含量提高2.6倍,长链n-6多不饱和脂肪酸含量没有显著变化,而n-6/n-3比例显著降低(P < 0.01)．同时蛋白质印迹检测到人过氧化氢酶hCAT在小鼠的肌肉组织中表达,且过氧化氢酶活性比野生型小鼠显著提高(P < 0.01)．     

少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ6 脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT PCR ,获得一个 5 93bp的cDNA片段 ,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物 ,通过cDNA末端扩增技术 (RACE)获得该cDNA的 3′和 5′序列 ,从而得到全长为 14 82bp的cDNA序列。序列分析结果表明 ,该序列具有一个长度为 1377bp、编码 4 5 8个氨基酸的开放阅读框 ,所编码蛋白质的大小为 5 2kD。与报道的Δ6 脂肪酸脱氢酶一样 ,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的 3个组氨酸保守区和疏水结构 ,在其氨基酸序列的N 末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区。该序列为一个新的编码Δ6 脂肪酸脱氢酶的基因 ,为了验证其功能 ,把开放阅读框序列RAD6亚克隆到表达载体 pYES2 0 ,构建重组表达载体pYRAD6 ,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱 /质谱 (GC MS)分析表明 ,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的酶具有Δ6 脂肪酸脱氢酶活性 ,能将外源性的底物亚油酸转化为γ 亚麻酸 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 3 85 %。     

△12-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达

把高山被孢霉(Mortierella alpina)和深黄被孢霉(Monierella isabellina)的△^12-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET21a中,获得重组表达载体pMACL12和pMICL12,并用氯化钙方法将重组表达载体转化到大肠杆菌B121(DE3)中。筛选阳性克隆进行培养,然后分离其细胞膜蛋白,并构建体外表达体系,同时加入外源性底物油酸进行表达。经气相色谱(GC)分析表明,分别有17．87％和17．60％的油酸转化为亚油酸。     

Δ12-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达*

把高山被孢霉 (Mortierellaalpina)和深黄被孢霉 (Mortierellaisabellina)的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET21a中 ,获得重组表达载体pMACL12和pMI CL12 ,并用氯化钙方法将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中。筛选阳性克隆进行培养 ,然后分离其细胞膜蛋白 ,并构建体外表达体系 ,同时加入外源性底物油酸进行表达。经气相色谱 (GC)分析表明 ,分别有 17.87%和 17     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在红冬孢酵母中的表达

以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,将质粒pRH2304转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析,荧光显微观察结果表明GFP在YM25235获得表达,建立了红冬孢酵母YM25235遗传转化方法。在此基础上,以高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因取代pRH2304中的GFP基因,构建重组质粒pRH2304MAD6,将其转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析。PCR结果表明,高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已经整合到YM25235基因组中,进一步的脂肪酸气相色谱分析结果表明,该基因编码产物催化n-6途径中的亚油酸转化成γ-亚麻酸,占细胞总脂肪酸的4.35%,但没有检测到催化n-3途径中的α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸。     

小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

Δ8途径是合成多不饱和脂肪酸的替代途径,Δ8-脂肪酸脱氢酶是该途径的关键酶之一。根据已报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因设计引物,分别从小眼虫藻基因组DNA和cDNA中扩增得到该基因片段,序列分析表明：结构基因长1 266 bp,编码421个氨基酸;该基因没有内含子,比已经报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因长6 bp,并且N末端序列也有所不同。利用酿酒酵母的载体pYES2.0构建Δ8-脂肪酸脱氢酶表达载体pYEFD,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中,在选择培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YD8。YD8在合适的培养条件下,添加外源底物二十碳二烯酸和二十碳三烯酸并诱导基因表达。脂肪酸甲酯气相色谱分析表明小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效表达,将二十碳二烯酸和二十碳三烯酸分别转化成二高-γ-亚麻酸和二十碳四烯酸,其底物转化率分别达到了31.2％和46.3％。     

卷枝毛霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

为获得产高γ 亚麻酸的酿酒酵母工程菌株,应用RT PCR技术,从卷枝毛霉中扩增出△6 脂肪酸脱氢酶 基因,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYES412,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScI中,在SC ura合成培养基中筛选到转化酵母,在合适 的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体,通过气相色谱对转化酵母进行脂肪酸 色谱分析,结果表明:γ 亚麻酸占总脂肪的50.07%。迄今为止,这是国内外△6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母表 达量最高的报道。     

雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌Δ6-脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉(Thamnidium elegans)As3.2806Δ6-脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)向两端延伸得到1504bp的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSc1的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSc1中异源表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸(GLA)的含量占酵母总脂肪酸的7.5%。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(GenBank,AY941161)。     

花生AhFAD2基因抑制表达的转基因后代分析

FAD2(Δ~(12) fatty acid desaturase,Δ~(12)FAD或FAD2)是催化油酸在脂肪酸碳链Δ~(12)位脱氢生成亚油酸的关键酶。在花生中,FAD2酶活性下降或失活可提高籽粒中油酸的相对含量,改善花生籽粒及制品的品质和氧化稳定性。通过将种子特异性表达Lectin启动子和Ca MV35S启动子驱动的倒位重复Ah FAD2基因RNAi干扰结构转入花生,获得了以丰花1号(FH1)和花育23(HY23)为受体、携带上述2种转化结构、稳定遗传的花生转基因纯合体株系,转基因花生主要农艺性状与非转基因对照基本一致。实时荧光定量分析发现,各转基因株系发育种子中Ah FAD2基因的转录水平普遍下调。气相色谱法进一步测定了部分转基因后代株系种子的脂肪酸含量及组成,籽粒中油酸含量分别平均提高了15.09%(HY23为受体)、36.40%(FH1为受体),相应地,亚油酸含量平均下降了16.19%、29.81%,油亚比平均增加了38.02%、98.10%。各转基因株系的油酸含量显著提高;且在以FH1为受体的转基因株系后代籽粒以及种子特异性启动子驱动的转化结构中,RNAi的抑制效果更明显。通过RNAi技术抑制花生FAD2基因的表达,可以有效提高花生籽粒油酸含量。该技术体系可以为花生品质育种提供借鉴。     

深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生γ 亚麻酸 ,从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI12 1连接 ,构建了重组质粒pBMICL6 ,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导入到栽培大豆吉林 35、吉林 4 3、吉林 4 7、绥农 10、绥农 14和黑农 37等品种中 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析 ,结果表明Δ6 脂肪酸脱氢酶基因获得表达 ,产生了γ 亚麻酸 ,其含量最高可达 2 7 0 6 7% ,这是国内外深黄被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在大豆中表达的首次报道     

普通烟草八氢番茄红素脱氢酶基因的原核表达及表达谱分析

基于NCBI数据库中本氏烟(Nicotiana benthamiana)的烟草八氢番茄红素脱氢酶PDS基因(ABE99707)的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以烟草栽培品种红花大金元叶片总RNA为模板,通过PCR方法获得了烟草NtPDS基因的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1749 bp,编码582个氨基酸,推测该蛋白等电点为7.53,理论分子量为65.04 kD。通过构建融合表达载体pET-32a-NtPDS,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃下经1 mmol/L IPTG诱导4 h表达后,产生了以可溶性蛋白形式存在的NtPDS融合蛋白,并通过Western blotting验证融合蛋白获得表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在烟草的叶片、花和茎中均有表达,在根中没有表达。该结果为进一步研究烟草八氢番茄红素脱氢酶NtPDS的活性和生物学功能奠定了基础。     

花生防御素基因的克隆及原核表达

定基础.     

深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因烟草中的表达

γ 亚麻酸 (GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸 ,在大多数油料作物种子中不含有GLA ,而只含有其前体物亚油酸 ,只有少数油料植物种子中含有GLA ,如夜来香 (Oenotheraspp) ,琉璃苣(Boragoofficinalis)等。Δ6 脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ 亚麻酸 ,为了能够在传统的油料作物种子中产生GLA ,我们将从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,与植物表达载体pGA6 43连接 ,构建了重组质粒pGAMICL6 ,将其通过农杆菌介导法 ,导入模式植物烟草中。经PCR和Southern杂交分析表明该基因已导入并整合到烟草的基因组中 ,Northern杂交结果表明该基因在转基因烟草的mRNA水平上获得表达。对转基因植株进行脂肪酸分析 ,结果显示 ,GLA和十八碳四烯酸 (OTA)分别占总脂肪酸含量的 19 7%和 3 5 %。     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶(LeFAD3)基因的部分编码区,该片段cDNA为309 bp,将其克隆到pET-30a(+)载体中,酶切位点分别是BamH I和Sac I,构建了原核表达载体pET-LeFAD3,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,经IPTG诱导蛋白表达,提取蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.酶切鉴定结果表明,LeFAD3基因原核表达载体构建成功,目的蛋白成功表达.