人胰腺细胞培养及胰岛素的分泌

人胰腺细胞培养及胰岛素的分泌王石泉,汤国枝,张鹤云,李敏意,金以丰（南京大学生物化学系,南京２１００９３）胰岛β细胞的体外培养获得胰岛素已有报道,但大多采用新生大鼠胰腺,且β细胞成活率低,分泌量少,还处在研究阶段［１－４］．本实验采用人胰腺细胞做较大...     

血红素加氧酶／一氧化碳系统在1，6-二磷酸果糖抗IL-1β致胰岛细胞凋亡中的作用

目的：探讨1,6-二磷酸果糖（FDP）对白介素-1β（IL-1β）致胰岛细胞凋亡的保护作用及其机制与血红素加氧酶／一氧化碳（HO-1／CO）系统的关系。方法：应用离体培养乳鼠的胰岛细胞,分别检测IL-1β、FDP作用后细胞形态、细胞活性、细胞凋亡率、细胞HO-1的活性和细胞培养上清液中胰岛素的基础和高糖刺激分泌量以及CO的含量的变化,同时设立正常对照组。结果：正常胰岛细胞HO-1活性较低,CO含量少,凋亡细胞率为4．71±0．62。IL-1β作用20h后,与正常组比较胰岛细胞活性明显降低,基础和高糖刺激胰岛素分泌减少,胰岛细胞凋亡率明显增加（P〈0．01）;细胞HO-1活性有所增加,上清液中CO生成增多（P〈0．05）,损伤后与FDP共同孵育细胞活性显著升高,胰岛素基础和高糖分泌量增多,胰岛凋亡率明显降低,HO-1活性和CO生成显著提高（P〈0．01）,具有统计学意义。结论：FDP能降低IL-1β诱导胰岛细胞的凋亡,改善细胞活性,促进细胞的分泌功能,机制可能与FDP增加HO-1活性,从而CO生成增多有关。     

微囊化胰岛B细胞系体外生长和分泌功能的研究

目的：研究海藻酸钠－多聚赖氨酸－海澡酸钠（APA）微囊化胰岛B细胞系BTC6－F7的生长和分泌规律,探索其作为生物人工胰岛的可能性。方法：以微囊静电液滴发生器制作APA微囊化BTC6－F7细胞,体外培养并定期测定微囊化细胞的生长和胰岛素分泌。结果：在实验观察的90d内,BTC6－F7细胞可在微囊内以细胞团的形式生长、存活。囊内细胞总数随培养时间的延长而增加,但细胞活率呈下降趋势,胰岛素分泌与囊内活细胞数的变化规律一致,最初呈上升趋势,然后较长时间维持在相对恒定的水平。结论：本研究所制备的APA微囊化胰岛B细胞可在较长时间内保持生长、存活和分泌功能,为进一步发展生物型人工胰岛奠定了基础,并可用于糖尿病的发病机理和治疗研究。     

两种培养液对小鼠胰岛细胞培养后的形态和功能的影响

目的:考察两种胰岛细胞培养液对小鼠胰岛细胞培养后的细胞形态和功能的影响。方法:分别以RPMI1640和低糖型DMEM为基础配制两种胰岛细胞培养液,与小鼠胰岛细胞共培养24 h,用FD-PI染色观察胰岛活性,透射电镜观察胰岛细胞内部形态,并用连续葡萄糖灌流刺激试验考察胰岛素释放功能。结果:两种胰岛细胞培养液24h内对培养的胰岛活性影响无差异,但透射电镜结果显示以低糖型DMEM为基础的培养液培养的胰岛细胞间隙较小,且葡萄糖灌流结果显示其培养的胰岛细胞后续胰岛素分泌能力显著增加。结论:以低糖型DMEM为基础配制的胰岛细胞培养液能较好地保持培养胰岛的结构和功能。     

单克隆人胰腺干细胞分化特性的研究

研究1例来源于4月龄男性流产胎儿胰腺组织的单克隆人胰腺干细胞（monoclonal human pancreatic stem cell,mhPSC）系的体内外分化特性。将mhPSCs接种在铺有0．1％明胶的培养皿内,扩增培养3d后,加高糖DMEM诱导液诱导培养25d。相差显微镜下．观察细胞生长状况。采用双硫腙染色法、RT—PCR及葡萄糖刺激释放胰岛素和C肽实验．对体外定向诱导mhPSCs分化为功能性胰岛进行检测。将mhPSCs悬液注射在成年雄性裸鼠腹股沟皮下．注射30d时,取出移植物,采用SP法进行免疫组织化学反应,以检测mhPSCs的体内自然分化潜能。体外扩增培养,mhPSCs贴壁生长,呈多角形上皮样。生长至单层．呈“铺路石”状。体外定向诱导,细胞逐渐由多角形变成圆形,并聚集成类胰岛。诱导培养15d时．形成的类胰岛中少数细胞分化为B细胞,双硫腙染色阳性。诱导培养25d时,多数细胞分化为8细胞,双硫腙染色阳性,转录表达胰岛素的mRNA。用不同浓度葡萄糖刺激．诱导胰岛不仅释放胰岛素和C肽,而且其释放量随糖刺激浓度升高显著增加（0．01〈P〈0．05）。体内分化实验显示,mhPSCs在裸鼠背部形成类畸胎瘤。类畸胎瘤易与裸鼠分离,色白,血管丰富。显著表达pdx1、胰岛素、胰高血糖素、CK、MBP及NF蛋白。该研究结果证实单克隆人胰腺干细胞系体外定向诱导分化为包含大量β细胞的功能性类胰岛,在体内自然分化为胰岛、上皮及神经组织细胞。     

柯萨奇B4病毒在体外对小鼠胰岛素分泌功能的影响

柯萨奇B4病毒（CB4V）感染被认为和胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）的发病有关。我们对体外培养的小巴胰岛和胰岛细胞经CB4V感染后,检测其胰岛素分泌功能。结果显示,病毒感染组的胰岛包膜的消失较对照组早;糖刺激的胰岛素释放量明显低于对照组,但CB4V并不引起胰岛细胞的溶解。这表明：（1）CB4V可在体外感染小鼠胰岛和胰岛细胞。（2）CB4V可损害胰岛β－细胞合成胰岛素的功能。     

环孢霉素A抑制NIT-1胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌

为研究免疫抑制剂环孢霉素A对NIT-1胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌的影响,体外培养NIT-1胰岛β细胞,用不同浓度的环孢霉素A处理48h和72h,MIT法检测NIT-1胰岛β细胞的增殖情况,放射免疫测定法(RIA)检测胰岛素释放。实验结果显示环孢霉素A处理48h和72h可显著抑制细胞的增殖和胰岛素的释放,可见免疫抑制剂环孢霉素A对NIT-1胰岛β细胞有直接的细胞毒作用。     

IL-1β对体外培养NIT-1β细胞胰岛素分泌的影响

利用小鼠胰岛β细胞系NIT 1细胞,对不同时间、不同浓度IL 1β作用下细胞的生长和胰岛素的分泌进行观察,以研究IL 1β对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响,探讨细胞因子对胰岛β细胞功能的抑制作用.结果显示在IL 1β作用下,各组NIT 1细胞分泌胰岛素呈不同程度降低,表明IL 1β对NIT 1β细胞系胰岛素的分泌具有显著抑制作用.     

Cell | 首次鉴定出胰岛成体干细胞

糖尿病主要是胰岛β细胞功能失常导致的胰岛素分泌不足引起的，由于缺乏足够的供体胰岛进行移植治疗，许多患者需要终生使用胰岛素维持健康。若可体外培养获取移植用胰岛β细胞，将给糖尿病患者带来巨大福音。中国科学院分子细胞科学卓越创新中心曾艺课题组通过对成年小鼠胰岛进行单细胞转录组测序，成功找到了胰岛中特异表达Procr的成体干细胞，这类Procr+细胞可以在体外培养获得有功能的胰岛类器官(2020年3月19日在线发表，doi:10.1016/j.cell.2020.02.048)。研究人员通过谱系示踪发现这类Procr+细胞可以在正常生理条件下分化出胰岛中所有的细胞类型，包括Alpha、Beta、Delta和PP 细胞。同时，他们通过3D培养体系成功建立了在体外能够迅速地响应糖刺激、分泌胰岛素的有功能的胰岛类器官。并且，这些胰岛类器官移植到糖尿病小鼠体内能够挽救小鼠的糖尿病表型。体内外实验均展示了Procr+细胞的干细胞性质，为未来糖尿病的治疗提供了理论依据和技术支持。     

大鼠骨髓间充质干细胞培养、鉴定与成胰岛样β细胞诱导

为治疗糖尿病寻找新的胰岛β细胞替代物,该研究对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)进行了体外分离培养、鉴定及成胰岛样β细胞诱导。应用全骨髓离心贴壁培养法分离大鼠BMSCs,进行培养、传代、表面标志物检测,利用DMSO和高糖环境对BMSCs进行胰岛样β细胞诱导。结果显示,大鼠BMSCs体外培养细胞形态呈成纤维细胞样,可以稳定传代;CD13、CD44和CD106表达呈阳性,CD49d呈阴性。在成胰诱导条件下,BMSCs可形成胰岛样圆形细胞团,双硫腙染色呈棕红色,PDX1(pancreatic duodenal homeodomain 1)、CK19(cytokeratin 19)、巢蛋白、胰岛素免疫组化染色均呈阳性;经RT-PCR检测发现,成胰诱导后的BMSCs中表达胰岛素、PDX1和glucagon基因;经q-PCR检测发现,成胰诱导后的BMSCs中胰岛素m RNA水平是大鼠胰腺成体干细胞(pancreas adult stem cells,PASCs)的1.09倍(P0.05);同时,有相应量的胰岛素合成。结果表明,分离得到大鼠BMSCs体外生长稳定,能转分化为胰岛样细胞,该研究结果为糖尿病治疗提供了新的实验依据。     

链脲佐菌素致胰岛NO自由基损伤模型的建立和应用

以链脲佐菌素Streptozotocin（简称STZ）为糖尿病的诱因,以NO自由基含量为响应指标,建立了体外小鼠胰岛水平糖尿病药物筛选模型。当STZ作用浓度在0～50mmol/L内变化时,培养液中被检测到的NO大部分是来源于STZ溶于水后释放出的,而很小一部分是由胰岛培养物自身释放的,后者稳定在30～35mmol/L之间。另一方面,NO含量与胰岛素分泌量的剂量关系表明NO的增加伴随着胰岛素分泌量的下降,这标志着NO对胰岛功能的氧化性损伤,从而验证了NO作为该模型响应参量的可靠性。最终确定STZ致胰岛NO自由基损伤模型中STZ的作用浓度为5.0mmol/L,此时NO含量和胰岛素分泌量分别为STZ未加入前的10.81倍和0.43倍。最后应用该模型,快捷地考察了不同铬含量的魔芋葡甘露寡糖铬络合物（简称KOSCr）清除NO自由基的能力。     

一种高效经济的小鼠胰岛细胞分离纯化新技术

目的:建立一种经济高效的小鼠胰岛细胞分离纯化方法,为进行NOD小鼠的胰岛移植提供实验条件.方法:将5-7周龄、体重20～25 g的雄,陛昆明小鼠的胆总管结扎,并逆行Hank's液和胶原酶P灌注和分离消化,依次加入84%、67%、50%浓度的Histopaque介质后进行不连续密度梯度离心纯化胰岛细胞.双硫腙(dithizon,DTZ)和台盼兰染色分别鉴定胰岛细胞.用含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液体外培养胰岛细胞,培养后的第3、5、7、9、11天取细胞上清检测胰岛素水平,并用16.7mmol/L的高浓度葡萄糖进行刺激,检测胰岛素水平确定胰岛细胞功能.结果:每个胰腺的胰岛细胞收获量在1200±124个,且纯度和活性均大于90%;体外培养9天内胰岛细胞基础胰岛素分泌水平无显著差异,至第11天时则明显减少(P＜0.05);应用16.7mmol/L葡萄糖刺激后,第5、7、9、11天的胰岛素分泌水平较第3天的明显减少(P＜0.05),然而在第7天、9天、11天时的胰岛素水平较第5天时显著降低.结论:胆总管逆行注射Hank's液和胶原酶P消化消化和不连续密度梯度Histopaque纯化的方法可以获得大量状态良好的胰岛,且胰岛细胞数量多,分泌状态良好.本分离方法是一种经济高效的胰岛细胞分离方法,同时离体后于5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养第3天胰岛细胞胰岛素储备功能最佳,为移植研究的最佳状态.     

再生胰腺提取物诱导人羊膜间充质干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞

利用天然生物诱导剂大鼠再生胰腺提取物(Rgenerating pancreatic extract,RPE)定向诱导人羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)向胰岛素分泌细胞分化。切除大鼠60%胰腺刺激胰腺再生,而后制备RPE,以终浓度为20 mg/L的RPE诱导hAMSCs。实验通过形态学鉴定、双硫腙染色、免疫荧光分析、RT-PCR基因检测和高糖刺激胰岛素分泌等实验鉴定细胞诱导结果。实验结果显示P3代hAMSCs经RPE诱导后形态变化明显,诱导15 d后细胞呈簇状生长,经双硫腙染色可见棕红色细胞团;免疫荧光染色结果显示诱导细胞呈胰岛素阳性表达;RT-PCR实验证明诱导细胞阳性表达人胰岛相关基因Pdx1和insulin;高糖刺激实验证明培养液中有胰岛素成分产生,且分泌量随刺激时间的延长先增加而后趋于稳定。实验结果表明hAMSCs在体外经RPE诱导可以分化为胰岛素分泌细胞。     

依法克生对大鼠胰岛细胞损伤的保护作用

目的探讨炎症因子对体外培养大鼠胰岛细胞的损伤情况及依法克生可能的保护作用。方法将分离、纯化的SD大鼠胰岛细胞置于体外培养,观察炎症因子IL-1β不同浓度(0.1~10 ng/ml)和不同作用时间(0~48 h)下对胰岛细胞分泌功能影响。胰岛细胞分为对照组、IL-1β组和依法克生组,用单因素方差分析比较各组在低糖和高糖环境下的胰岛素分泌,观察依法克生对胰岛素分泌的影响,对胰岛功能IL-1β损伤的保护作用,并比较三组间胰岛细胞凋亡率。结果高糖浓度下,随IL-1β浓度升高,胰岛素分泌下降(P0.001),随作用时间延长,胰岛素分泌亦减少(P0.001),IL-1β浓度超过5.0 ng/ml、时间超过24 h抑制作用较为明显。依法克生组胰岛素分泌较IL-1β组明显升高(P0.001),与对照组无差异。胰岛细胞凋亡在IL-1β组(49.7±15.5)﹪高于对照组(9.7±2.5)﹪(P0.01),在依法克生组(15.7±5.5)﹪低于IL-1β组(P0.01),提示干预后胰岛细胞凋亡明显减少。结论 IL-1β抑制高糖环境下胰岛素的分泌,并存在剂量和时间依赖关系。依法克生加入体外培养的胰岛细胞中,可有效防止IL-1β诱导胰岛细胞损伤,逆转被抑制的胰岛分泌功能,并减少胰岛细胞凋亡。     

新生SD大鼠岛源性胰岛祖细胞的分离培养与诱导分化

目的：分离培养新生大鼠岛源性胰岛祖细胞,观察GLP-1（7-36）NH2诱导其向成熟细胞分化作用。方法：分离与纯化胰岛,在含20μg／LEGF和20μg／LbFGF的RPMI1640培养基中分离和扩增胰岛祖细胞．用20nmol／LGLP-1（7-36）NH2诱导分化。用原位杂交、免疫细胞化学染色、二硫腙（DTZ）染色和放射免疫分析等方法对的胰岛祖细胞分化前后细胞特征进行初步鉴定。结果：胰岛祖细胞表达Nestin,不表达PDX-1、InsulinmRNA、Insulin、Somatostatin。以GLP-1（7-36）NH2诱导分化后,部分细胞表达PDX-1、胰岛素mRNA、胰岛素、生长抑素,胰岛样细胞团（Ic＆）形成,其周边细胞DTZ着色。分化3周后培养基中胰岛素释放明显增加。结论：在新生SD大鼠胰岛存在有一类胰岛祖细胞,可以被分离并在体外不断扩增。GLP-1（7-36）NH2可以诱导胰岛祖细胞形成有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团。     

白细胞介素—1β对胰岛素分泌的抑制及睾酮的反转作用

离体培养新生大鼠胰岛细胞ＩＬ－１β（５－２０Ｕ／ｍｌ）处理２０ｈ后,可使胰岛细胞在高糖（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）刺激下的胰岛素释放量明显降低。对ＩＬ－１β处理后的胰岛给予睾酮（１０＾－１０ｍｏｌ／Ｌ）,则能反转ＩＬ－１β的抑制效应,并且睾酮不仅增加胰岛素分泌,而且还可促进胰岛细胞内胰岛素含量的增加。     

单纯生物学制剂诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞快速分化

为探讨用单纯生物学制剂诱导人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord,hUC-MSCs)向胰岛素分泌细胞分化的可行性,本研究用胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶次序消化及两步离心法从人胎儿完整脐带中分离、纯化出hUC-MSCs;用表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、银杏提取液和高糖培养基IMDM诱导hUC-MSCs向胰岛素分泌细胞分化。在hUC-MSCs诱导前后,用倒置显微镜观察其形态变化,RT-PCR检测其胰岛相关基因的表达;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团(islet-like clusters,ILCs);细胞免疫荧光染色检测ILCs中PDX-1和免疫活性胰岛素(immunoreactive insulin,IRI)的表达;化学发光法检测ILCs的IRI分泌量;Western blot鉴定IRI的性质。结果显示:纯化的hUC-MSCs呈间充质干细胞特有的形态特征:长梭形,平行或螺旋形排列;在上述单纯生物学制剂的诱导下,hUC-MSCs逐渐变圆并聚集成团;在25cm2培养瓶的细胞生长面可见上百个ILCs;ILCs表达胰岛特异性基因pdx-1、insulin;ILCs呈PDX-1和IRI免疫染色阳性反应,双硫腙染色呈阳性;ILCs可分泌IRI,但多为胰岛素原(proinsulin,PI)。以上结果提示,用表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、银杏提取液和高糖培养基IMDM可诱导hUC-MSCs快速分化为胰岛素分泌细胞,但ILCs功能不够成熟,难以产生足量真胰岛素。     

保护胰岛β细胞的体外研究进展

糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷和（或）胰岛素作用缺陷引起的高血糖症性代谢疾病。自Edmonton临床试验取得成功后,胰岛移植成为一种新型治愈糖尿病的方法。但胰岛β细胞在体外分离过程中极易发生凋亡或死亡,且长期的体外培养或冷冻储存也容易令其胰岛素分泌功能逐渐丧失。因此,有效维持或改善β细胞的成活率及功能对胰岛移植的成功至关重要。对胰岛β细胞的体外保护方法进行阐述,并对其研究前景进行展望。     

杨梅黄酮通过Wnt通路改善细胞因子诱导的胰岛β细胞功能障碍的实验研究

本文探讨杨梅黄酮对细胞因子诱导的胰岛β细胞功能障碍的影响及Wnt通路在其中的作用.MTT法检测细胞的存活率;放射免疫法检测RIN-m5fβ细胞在基础状态和高糖状态下胰岛素的分泌水平;Western blot法检测Wnt通路相关蛋白的表达情况.肿瘤坏死因子α、白介素1β和γ干扰素联合作用细胞48 h后,与空白对照组相比,细胞的存活率显著下降;基础状态下胰岛素的分泌量增加至空白对照组的2.45倍,而高糖刺激状态下胰岛素的分泌量减少至空白对照组的39.6%.Western blot结果显示,细胞因子处理后使Wnt通路相关蛋白的表达量下降.而杨梅黄酮作用后,与细胞因子组相比,可使细胞存活率上升.另外,20μmol/L杨梅黄酮可逆转细胞因子对胰岛素分泌的影响,使基础状态下胰岛素的分泌减少,高糖刺激状态下胰岛素分泌量显著增加.Western blot结果显示,杨梅黄酮提高了Wnt通路相关蛋白的表达水平.上述结果表明,细胞因子联合作用48 h能诱导RIN-m5f细胞功能障碍,杨梅黄酮干预后能减少这种细胞损伤,保护机制可能与其激活Wnt通路有关.     

白细胞介素－1β对胰岛素分泌的抑制及睾酮的反转作用

离体培养新生大鼠胰岛细胞用ＩＬ－１β（５—２０Ｕ／ｍｌ）处理２０ｈ后，可使胰岛细胞在高糖（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）刺激下的胰岛素释放量明显降低。对ＩＬ－１β处理后的胰岛给予睾酮（１０－１０ｍｏｌ／Ｌ），则能反转ＩＬ－１β的抑制效应，并且睾酮不仅增加胰岛素分泌，而且还可促进胰岛细胞内胰岛素含量的增加。