小鼠SOCS1基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建含小鼠细胞因子信号抑制因子-1基因(SOCS1)的重组腺病毒载体(Ad5F35-SOCS1),探讨其介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达。方法:设计含AgeI和NheI酶切位点的SOCS1基因上下游引物,以质粒pEF-FLAG-1/mSOCS1为模版,通过PCR扩增获得SOCS1全部序列,片段回收后经AgeI和NheI酶切,再定向插入到经AgeI和NheI酶切的质粒pDc316-LacZa中,获得重组穿梭质粒pDC316-SOCS1,经AgeI和NheI酶切、PCR及测序等鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-SOCS1与腺病毒骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,经位点特异性重组获得重组腺病毒Ad5F35-SOCS1,行PCR鉴定,经293细胞扩增、纯化制备高滴度病毒液,TCID50法测定病毒滴度。用获得的重组腺病毒感染小鼠树突状细胞,以免疫组化检测SOVD1的表达。结果:成功构建了含小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体,病毒感染滴度为1.4×10~9IU/ml,该载体能有效介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达。结论:重组腺病毒载体能将SOCS1基因转入小鼠树突状细胞并有效表达,为基因转染制备耐受性树突状细胞奠定了基础。     

去除致癌基因的EB病毒潜伏膜蛋白1的重组腺病毒的构建及其免疫效果

为进一步研究利用EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)进行免疫治疗的可行性,构建了含有去除致癌基因的EB病毒LMP1片段(LMP1△)的穿梭质粒pAdTrack CMV LMP1△,将它与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1用电转染的方法共同导入大肠杆菌BJ5183中,在宿主菌重组酶的介导下进行同源重组。通过抗性筛选,获得含有重组腺病毒基因的质粒;然后再通过脂质体将重组腺病毒质粒导入腺病毒包装细胞HEK293细胞中,在HEK293细胞E1蛋白的反式作用下,病毒被包装。将包装病毒的细胞裂解上清进行PCR鉴定证实,病毒DNA中含有目的基因的特异性片段。RT PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录,免疫酶和Westernblot的结果也显示,LMP1△蛋白在真核细胞得到表达。将扩增后的病毒感染HeLa细胞,测定病毒滴度为3.0×109PFU/ml。为初步探讨其免疫效果,采用肌肉注射和滴鼻的方式感染Balb/c纯系小鼠,免疫酶检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现,两种免疫途径均可诱发小鼠针对LMP1的特异性体液免疫和细胞免疫,而且Ad5作为免疫对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应。     

狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

果蝇硒蛋白dSelK基因重组腺病毒构建与表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统构建果蝇硒蛋白dSelK基因重组腺病毒并在AD-293细胞中包装扩增。方法:PCR扩增dSelK目的片段连接到穿梭载体pShuttle-CMV上,用电转化法将线性化的pShuttle-CMV-dSelK穿梭载体转入含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细胞中,构建重组腺病毒载体AdEasy-dSelK,线性化后转染AD-293细胞进行包装,并传代扩增,TCID50法测病毒滴度,Western blot鉴定。结果:成功构建腺病毒载体AdEasy-dSelK,经AD-293细胞包装扩增得到重组腺病毒,滴度为107.5。Western blot鉴定AdEasy-dSelK成功表达。结论:成功构建重组腺病毒载体pAdEasy-dSelK,为硒蛋白功能研究奠定基础。     

泛素与EB病毒核抗原1融合基因的DNA免疫研究

构建了EB病毒核抗原1(EBNA1)基因的表达质粒pCI-EBNA1和泛素(ubiquitin,Ub)与EBNA1融合基因的表达质粒pCI-Ub-EBNA1.间接免疫荧光和Western blot分析表明,两重组质粒转染HeLa细胞后均能瞬时表达.两种质粒DNA肌肉注射免疫Balb/C小鼠后,分别检测小鼠血清抗EBNA1的抗体和特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较单基因与融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度.结果显示:二者诱生抗体的效率无明显差别,但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强.     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验

构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果。本研究将编码PCV2Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap。将被限制性内切酶PacI线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap;以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5。病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右;一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响。RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达。以107 TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强。对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础。     

融合表达新冠病毒S1与N蛋白的非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

体外构建融合表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1抗原与N抗原的复制缺陷型重组腺病毒疫苗,为深入开展该疫苗免疫原性的研究提供基础。利用Overlap PCR和同源重组方法构建插入SARS-CoV-2的S1-N基因的重组腺病毒质粒pKAd5-S1-N,通过琼脂糖凝胶电泳、多酶切、测序等方法鉴定重组质粒正确性;重组质粒转染HEK293A细胞获得病毒毒种AdV5-S1-N并扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,有限稀释分析法测病毒滴度,Western blot方法验证AdV5-S1-N重组腺病毒S1-N融合蛋白表达情况;将AdV5-S1-N疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,第14d采集颌下静脉血,ELISA法检测血清针对S1和N蛋白抗原的特异性抗体滴度。成功获得滴度为9.45×10¹¹IU/mL的重组腺病毒AdV5-S1-N。Western blot结果发现：AdV5-S1-N感染细胞后,融合蛋白可正常表达,与抗S1蛋白及抗N蛋白抗体均有特异结合。ELISA结果显示免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对S1和N蛋白的特异性IgG抗体。应用复制缺陷型腺病毒载体成功获得...     

表达PRRSV M蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株的M蛋白基因,将其克隆重组到人血清5型腺病毒载体中,转染293细胞,制备重组腺病毒rAd-M.RT-PCR和IFA方法鉴定,结果表明rAd-M可表达M基因的mRNA和M蛋白.纯化的rAd-M重组腺病毒经293细胞连续传25代,滴度稳定为107.8TCID50/mL.动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒rAd M能够刺激机体产生PRRSV的特异性抗体免疫和细胞免疫应答反应,从而为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础.     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

炭疽杆菌保护性抗原(PA)重组腺病毒的构建及免疫效果分析

探讨利用腺病毒载体作为炭疽杆菌基因工程疫苗载体的可行性.从载体pcDNA3.1-PA上PCR扩增PA片断,将该片断克隆入质粒pAdTrack-CMV,得到阳性克隆pAdTrack-PA.PmeI线性化的阳性克隆转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组后得到重组腺病毒vAd-PA.vAd-PA经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,经Western- blot检测表明PA在293细胞中得到表达.重组病毒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法检测血清中产生了特异性抗体,抗体滴度计算几何均数为12800.该研究为进一步研究以腺病毒为活载体的疫苗奠定了基础.     

甲型H5N1流感病毒M2与HA双基因载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价

高致病性H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) 严重威胁到人类健康,因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意义。以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 作为研究对象,PCR扩增基质蛋白2 (M2) 和血凝素 (HA) 基因全长开放阅读框片段,构建共表达H5N1亚型AIV膜蛋白基因 M2和HA的重组质粒pStar-M2/HA。此外,还通过同源重组以293细胞包装出表达M2基因的重组腺病毒Ad-M2以及表达HA基因的重组腺病毒Ad-HA。用间接免疫荧光 (IFA) 方法检测到了各载体上插入基因的表达。按初免-加强程序分别用重组质粒pStar-M2/HA和重组腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制 (HI) 实验检测到免疫后小鼠血清中的HI活性。ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M2蛋白和HA蛋白的特异性细胞免疫应答。流感病毒M2与HA双基因共免疫的研究,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。     

表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT-PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAd Track-MV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E．coli BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1：10000和1：1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100％。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。     

携带siSPK1重组腺病毒的构建及其对N2a细胞凋亡的影响

应用AdMax腺病毒载体系统构建携带siSPK1基因的重组腺病毒,进一步研究SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。设计可形成小发夹结构的SPK1-siRNA模板cDNA序列,克隆至质粒pDC316-siRNA,构建SPK1-siRNA穿梭质粒pDC316-SPK1,经鉴定正确后,将pDC316-SPK1与辅助包装质粒（pBHG loxΔE1,3 Cre）共转染至HEK293细胞,包装纯化并扩增重组腺病毒颗粒,终点稀释法测定病毒滴度;病毒感染N2a细胞,Western blot法检测SPK1蛋白的表达;Hoechst33258染色检测SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。酶切后PCR分析、测序鉴定表明,pDC316-SPK1构建成功,病毒纯化后滴度为2.50E＋10 PFU/mL;重组病毒可在蛋白水平抑制SPK1的表达;SPK1基因抑制后,N2a细胞凋亡增加（P〈0.001）。上述结果表明,含有SPK1-siRNA的重组腺病毒构建成功,且具有抑制SPK1蛋白表达的功能,该基因沉默后,N2a细胞凋亡增加。     

携带人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的构建及其免疫效应检测

制备携带卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗,并研究其对小鼠的免疫效应。将卵泡刺激素受体胞外区(fshr366)基因克隆到慢病毒载体上,采用脂质体转染法将重组质粒转染至293T细胞中,包装并产生含有目的基因的病毒颗粒;分别利用RT-PCR和Western blot检测感染病毒颗粒的293T细胞中fshr366在m RNA水平及蛋白水平的表达情况;用携带fshr366的病毒颗粒单次腹腔免疫BALB/c小鼠,分别在免疫0、14、21和28 d对小鼠眼眶采血,ELISA法检测免疫小鼠血清的特异性并测定抗体滴度。酶切和测序结果表明fshr366基因片段成功构建到慢病毒载体上。将包装产生的携带fshr366的慢病毒颗粒感染293T细胞后,RT-PCR和Western blot检测结果表明细胞在转录水平和蛋白水平均表达fshr基因。ELISA结果显示携带fshr366的慢病毒颗粒单次腹腔免疫小鼠后,免疫14 d就激起了机体的体液免疫反应,抗体滴度达到1∶1 600。成功制备了携带卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗,其可以在小鼠体内激发FSHR抗原特异的早期持续性免疫反应。     

腹腔注射重组腺病毒诱导的免疫反应

为研究重组腺病毒接种实验动物后的免疫反应性,利用RT-PCR方法,从HAV的RNA中克隆了结构蛋白基因插入穿梭质粒pXCX2Not I,通过磷酸钙-DNA共沉淀技术,将复制缺陷型腺病毒载体与线形化的pXCX2 CMV-HAV共转染293细胞.一系列检测方法证明产生了重组腺病毒rAdHAV.纯化后的rAdHAV滴度为1×109TCID50/mL,腹腔注射免疫昆明种小白鼠后,可诱导产生抗HAV IgG和HAV中和抗体.复制缺陷型腺病毒可作为发展基因工程病毒疫苗载体的有效系统.     

汉滩病毒膜蛋白重组腺病毒的构建表达及免疫效果研究

探讨利用腺病毒载体作为汉滩病毒基因工程疫苗载体的可行性。通过PCR扩增,得到完整的汉滩病毒76-118株M片段编码区,将该片段克隆入质粒pAdTrackCMV的CMV启动子下游,得到阳性克隆pAdTrackCMV—M。Pmel线性化的阳性克隆与腺病毒骨架载体pAdEasy—1共转化大肠杆菌BJ5183,经同源重组后得到重组病毒pAdEasy—M。pAdEasy—M经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,经Western—blot检测表明,G1、G2基因在293细胞中得到表达。重组病毒免疫BALB／c小鼠,产生了具有一定中和活性的抗体。该研究为进一步研制以腺病毒为活载体的工程疫苗奠定了基础。     

携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建

目的采用体外连接技术构建含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的重组腺病毒载体,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具。方法将pTurbo RFP-N上的含红色荧光蛋白基因片段,经酶切连接定向克隆至转移载体pShuttle上,构成重组质粒pShuttle-TurboRFP-N。用I-CeuI/PI-SceI双酶切重组质粒pShuttle-TurboRFP-N和骨架质粒pH5′040 pkGFP-II,回收目的片段,连接,获得重组腺病毒载体pH5.′040.CMV.RFP-N。将其线性化后,经脂质体介导转染至AD293细胞内包装出重组腺病毒颗粒。通过荧光显微镜观察其在AD293细胞内的包装效率和RFP表达情况。扩增并再次感染AD293细胞检测病毒颗粒感染能力,并测定其生物活性及滴度。结果经酶切鉴定,证明已正确构建重组腺病毒载体AdH5.′040.CMV.RFP-N;经AD293细胞包装成具有感染性的病毒颗粒,并能在真核细胞中高效表达目的基因;扩增纯化后获得重组腺病毒颗粒数为3.6×1012vp/mL,滴度达1×1010pfu/mL。结论成功构建了携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体,并能够在AD293细胞中高效地表达,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具。     

表达猪瘟病毒石门株E2抗原的重组腺病毒构建及免疫性研究

应用PCR从pMD18-T-E2质粒中扩增编码猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带CSFVE2基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E2,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E2,PCR证实E2基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒转染293细胞中E2蛋白的表达。ELISA检测结果表明,pAd-E2能刺激小鼠产生高效价的抗体,也能刺激猪体产生抗体。将pAd-E2通过肌肉和皮下接种途径免疫商品化猪2次,21d后用1000倍TCID50CSFV强毒攻击。pAd-E2免疫组有1/4头死亡,而非重组腺病毒pAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡。该研究为研制猪瘟基因工程疫苗提供了有用的数据。     

禽腺病毒QU株一个复制非必需区的鉴定

禽腺病毒QU弱毒株属于鸭腺病毒1型病毒, 可作为潜在的重组疫苗载体。为确定QU株的复制非必需区, 参照鸭腺病毒1型病毒基因组右侧E4区附近序列设计引物, 扩增QU株基因组的一段3.4 kb片段, 插入来自pEGFP-C1质粒的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒片段, 构建了含EGFP基因的重组质粒pADGFP。采用脂质体介导法, 将重组质粒pADGFP与QU株共转染CEF细胞, 用96孔板稀释法筛选纯化表达绿色荧光蛋白的重组QU病毒株rQUGFP。该重组毒的生长曲线与亲本毒一致, 连续传代后病毒滴度稳定。结果表明, QU株基因组右侧E4区附近一段包括ORF1、ORF8和ORF9三个开放阅读框的区域为病毒的复制非必需区, 且插入的EGFP基因可以稳定表达。为进一步以禽腺病毒QU株为载体构建重组疫苗的研究打下基础。     

表达PRRSV M蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株的M蛋白基因,将其克隆重组到人 血清5型腺病毒载体中,转染293细胞,制备重组腺病毒rAd-M。RT-PCR和IFA方法鉴定,结果表明rAd-M可表 达M基因的mRNA和M蛋白。纯化的rAd-M重组腺病毒经293细胞连续传25代,滴度稳定为107.8 TCID50／ mL。动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒rAd-M能够刺激机体产生PRRSV的特异性抗体免疫和细胞免疫应 答反应,从而为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础。