小鼠诺如病毒分离鉴定及病毒衣壳蛋白基因序列分析

目的了解广东地区小鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV）的分子遗传特征和进化来源。方法采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进行鉴定。应用RT-PCR技术针对15株MNV分离株的VP1基因的1626个核苷酸片段进行基因扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌中进行克隆。通过氨苄青霉素平皿筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定及序列分析。将这15株MNV分离株与从GenBank获得的19株MNV参考株进行序列比较分析,基于VP1基因的1626核苷酸片段构建系统发生进化树,一起进行分子流行病学研究。结果从80个小鼠样本中分离到了15株MNV病毒,通过细胞病变试验、RT-PCR试验、间接免疫荧光试验和测序分析鉴定确认分离到的病毒为MNV。序列分析结果显示MNV分离株的VP1蛋白基因全长均为1626个核苷酸,广东地区15株MNV分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别在89.7%~100%和94.8%~100%之间,15株MNV分离株与其他19株MNV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5%~92.9%和92.4%~98.2%之间。进化树分析表明来自设施A和设施D的13株病毒之间的亲缘关系较近,同属一个进化分支。来自设施B的ZD-1毒株和设施C的ZYY-163毒株与来自广东（K162）、日本（S7-P2、S7-PP3）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE、Berlin/05/06/DE）同属另一个进化分支。结论成功分离到15株MNV病毒。遗传进化分析表明广东地区的MNV分离株来源并不相同,来自设施B和设施C的MNV分离株与国外分离株的亲缘关系较近,而来自设施A和设施D的13株MNV分离株可能是本地固有的毒株。     

一株牛源阿卡斑病毒的分离鉴定

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)是能引起牛、绵羊、山羊流产、早产、新生胎儿畸形的虫媒性RNA病毒。为了解家畜虫媒病毒在我国西南边境地区的分布和流行情况,本研究对中缅边境西盟县的52份牛抗凝血和140份血清(牛70份、羊70份)中的蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、鹿流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)、AKV等虫媒病毒进行检测与分离,通过ELISA及qRT-PCR方法检测病毒,通过核酸阳性抗凝血接种BHK细胞传代以分离病毒,通过设计特异性引物,扩增分离毒株S基因721bp片段及M基因816bp片段,通过克隆测序及中和试验以鉴定病毒,最终从38号牛的抗凝血中分离到一株AKV,TCID50为10-3.5/0.1mL,经比对,分离株S片段与日本KS-2/Mo/06毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为97.66%,M片段与中国DHL10M110毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为96.56%。本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到AKV,证实了西南边境存在AKV的流行,为AKV在我国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据。     

一株赛鸽源鸽圆环病毒全基因克隆与序列分析

鸽圆环病毒(Pigeon circovirus,PiCV)是圆环病毒科的一个成员,是一种免疫抑制性病原。为了研究PiCV中国流行毒株的基因特征和遗传进化关系,本研究应用PCR方法对江苏省某赛鸽公棚的22份样品进行了PiCV检测,结果有6份样品为阳性。采用重叠PCR技术得到一株鸽圆环病毒全基因序列,命名为JS15-1(GenBank登录号:KX431143)。基因序列分析表明,JS15-1全长为2 034bp,包含3个主要开放阅读框。核苷酸同源性比较结果显示JS15-1与GenBank上登录的其他鸽圆环病毒分离株的全基因核苷酸同源性为85.3%~97.1%,与比利时分离的Bel20株同源性最高。不同鸽圆环病毒Rep基因同源性为92.1%~96.6%,Cap基因同源性为72.2%~99.4%。全基因遗传进化树显示JS15-1与之前的中国分离株处于不同的分支,而与Bel20的亲缘关系最近,Rep基因进化树显示JS15-1与Bel20、PiCV/Japan/2010、Ita4B位于同一分支,Cap基因进化树显示JS15-1与Bel20处于同一分支,亲缘关系最近。氨基酸序列比较发现,JS15-1与Bel20在Rep蛋白存在6个氨基酸残基的差异,而Cap蛋白存在1个氨基酸残基的差异和1个氨基酸残基的插入。研究结果表明,JS15-1极可能来源于比利时,而且发生了变异。     

一株猪源盖塔病毒的分离鉴定及遗传演化分析

盖塔病毒（Getah virus,GETV）是一种人畜共患病毒,近年来在动物中的感染时有发生,监测其流行情况以及控制其传播对公共卫生方面至关重要。本研究对一猪场流产胎儿脾脏样品进行二代测序,与NCBI数据库比对后,发现该序列与GETV HNJZ-S2毒株的基因组高度相似。对组织样品进行无菌处理,接种至PK-15细胞,经连续传代培养和空斑纯化,获得一株能在PK-15细胞上稳定生长的分离物,命名为GETV-YL株,并对其进行电镜观察与遗传演化分析。电镜结果显示,病毒颗粒呈球状,直径约为70 nm,有囊膜,表面有甲病毒典型的纤突结构。遗传演化分析结果显示,GETV-YL基因组全长11 689bp,与GenBank中现有的30株GETV全基因组序列相似性为94.4%～99.8%,与中国猪源毒株HNJZ-S2序列相似性最高（99.8%）并处于同一分支。在本研究中,从感染的猪中检测并分离到了GETV,表明该地区应加强对该病毒在猪群中流行情况的监测,并对该地区的蚊子进行病原检测。     

结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的检测。方法根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线;进行特异性、敏感性和重复性试验,最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本,验证在临床应用中的效果。结果该方法特异性强,与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数r2=0.9986,可以检测到10 copies/μL的质粒标准品,对MNV活病毒检测可检测到1.78×10-2TCID50/m L的病毒,检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍,比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测,检测到阳性样品103份,阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。结论建立的MNV荧光定量RTPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

采用ST细胞培养,免疫荧光、理化试验、中和试验、电镜观察等方法,从四川疑似猪腹泻病料中分离到1株猪传染性胃肠炎病毒,命名为SC-Y.分离株在ST细胞上盲传至第8代时可出现稳定的细胞病变,病毒滴度TCID50为10-3.664/0.05m1,中和指数为52.应用长链RT-PCR技术成功地扩增出了覆盖SC-Y株全长基因组的5个片段,通过BioEdit软件对测序结果进行拼接,确认SC-Y株基因组全长28 590bp,包括7个开放阅读框,基因组5非编码区长315nt,3'端非编码区长277nt.TGEV基因组系统进化树显示,SC-Y株与美国Purdue株可能来源于共同的祖先.     

一株新型云南牛环状病毒的分离鉴定

【目的】为加深云南省动物虫媒病毒多样性的认知。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛,定期采血接种细胞进行虫媒病毒的分离;通过RT-PCR、电镜观察与基因组琼脂糖凝胶电泳对分离病毒进行初步鉴定;扩增分离病毒的基因节段2 (Seg-2)与基因节段3 (Seg-3)全长序列进行分析与系统发生树的构建,明确病毒的分类地位;通过qRT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。【结果】2019年7月,从哨兵牛上采集的血液中分离到1株可在BHK-21细胞上引起细胞病变的病毒;电镜下观察,病毒粒子呈球形,直径约70nm;琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组由双链RNA组成,呈现"3-3-3"的带型特征。分离毒株的Seg-2编码环状病毒属病毒保守的T2蛋白,与Mobuck virus具有最近的亲缘关系,核酸与氨基酸序列相似度分别为72.8%与84.0%;分离毒株的Seg-3编码决定环状病毒属病毒血清型的OC1蛋白,与Mobuckvirus的核酸与氨基酸序列相似度仅为60.2%与56.5%;在T2与OC1蛋白构建的系统发生树上,分离毒株形成独立于Mobuckvirus的进化分支。对哨兵牛血液中的病毒核酸与血清中和抗体回溯分析结果显示,从病毒感染哨兵动物至监测期结束的17周内,动物血液中均可检测到病毒核酸;动物感染病毒1周后,开始产生特异性中和抗体,随后上升至最高水平(抗体效价1:226),至监测期结束,中和抗体仍维持在较高水平(抗体效价1:113)。【结论】本研究首次报道了1种新型Mobuckvirus在云南省哨兵牛上的分离与感染特性。研究结果丰富了对我国环状病毒属病毒的认知,为开展病毒的诊断、流行病学与致病性研究奠定了基础。     

一株兔出血症病毒2型毒株的分离鉴定

[背景]我国于2020年4月突发兔出血症病毒2型(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus 2,RHDV2)疫情,严重威胁兔养殖业和生态平衡,而且目前国内对RHDV2的病原学以及遗传特征等基础研究匮乏.[目的]分离鉴定RHDV2毒株,对分离株进行全基因测序与遗传进化分析.[方法]对成都某兔场疑似...     

鼠诺如病毒感染RAW264.7细胞中干扰素和干扰素激活基因转录水平研究

诺如病毒(Norovirus,NoV)是全球急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要致病原。鼠诺如病毒(Murine norovirus,MNV)是研究诺如病毒的理想研究模型。本研究通过实时定量荧光PCR检测急性感染毒株MNV-CW1和持续性感染毒株MNV-SH1603感染Balb/c小鼠后的排毒情况以及感染RAW264.7细胞后不同时间点病毒RNA扩增、干扰素(Interferon,IFN)和干扰素激活基因(Interferon-stimulated gene,ISG)转录水平,以探讨不同的MNV毒株感染诱导IFNs和ISGs基因表达的特征。研究显示MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染Balb/c小鼠后排毒时间不同。MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染RAW264.7细胞后,6h后出现明显扩增,48h达到病毒复制高峰,随后复制速度减慢。MNV-SH1603增殖比MNV-CW1快。两种病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54转录水平。MNV-CW1感染后,诱导IFN-β,IFN-λ2和ISG15基因表达上调,而ISG54在感染24h后转录水平下降。MNV-SH1603感染初期IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54基因转录水平持续增高,感染24h后IFN-β和ISG54的转录水平明显降低,IFN-λ2和ISG15转录水平峰值在感染后72h。研究揭示MNV病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN和ISG基因表达,但是MNV-CW1和MNV-SH1603诱导的基因表达特征有异同。     

四川省鸭坦布苏病毒的分离鉴定及遗传进化分析

本研究从四川省什邡市某发病养鸭场采集到疑似鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）感染的病料,将病料组织研磨,无菌处理后接种鸭胚连续传代培养,分离获得一株病毒,并通过PCR鉴定以及电镜形态观察,确定该分离株为黄病毒属坦布苏病毒,命名为SCS01。将SCS01株全基因组进行PCR分段扩增测序发现,SCS01株全基因组全长为10 992bp。在线BLAST比对检索,结果显示,SCS01株全基因组与国内鸭源坦布苏分离株同源性最高可达97.94%,进化树分析显示,SCS01株属于中国流行I群毒株,与多数分离自北方地区的中国II群毒株相比,具有较为明显的地方特性。分离株与所有参考毒株的E基因核苷酸和氨基酸相似性均在90%以上,其中与重庆分离株CQW1的相似性最高。这一鸭源坦布苏病毒的分离及其全基因组的测定为进一步探究坦布苏病毒的地区流行提供了材料。     

云南省墨江县库蠓中一株西藏环状病毒的分离及全基因组序列分析

西藏环状病毒（Tibet orbivirus,TIBOV）于2009年首次从中国西藏自治区采集的圆斑按蚊中分离出,目前在中国的云南省、广东省、湖南省和临国日本均有分离报道。2017年我们从云南省墨江县采集的库蠓样品中分离到一株病毒（MJC1-7）,接种BHK-21和C6/36细胞后均可产生聚集、皱缩和脱落等明显细胞病变。1%的琼脂糖凝胶电泳显示,病毒基因组为十节段的双链RNA,呈现“3-3-3-1”的带型。通过病毒全长cDNA扩增和测序获取MJC1-7毒株的全基因组核苷酸序列,病毒基因组全长为19 260 bp（包括编码区18 495 bp和非编码区735 bp）,由Seg-1(3 950 bp)至Seg-10(832 bp)的10个基因节段构成,可编码6 165个氨基酸残基。对环状病毒保守的VP1(Pol)、VP3(T2)和VP7(T13)蛋白氨基酸序列及系统发育分析显示,MJC1-7毒株与TIBOV亲缘关系最近,氨基酸序列相似度为95.4%～99.7%。对决定环状病毒血清型VP2(OC1)蛋白氨基酸序列与系统发育分析显示,MJC1-7与云南（SX-2017a、DH13C120和YN...     

一株传染性软化病病毒的分离和鉴定

病毒性软化病是一种严重影响蚕业生产的流行病,其病原为家蚕传染性软化病病毒(Bombyx moriinfectious flacherie virus,BmIFV)。本实验室在浙江省收集到具有软化病症状的家蚕幼虫,并分离纯化获得一株病毒。电镜观察到病毒粒子为直径26nm左右、无包涵体的球状颗粒。病毒添食四龄起蚕和五龄起蚕,分别在3~4d和5~7d出现明显症状和病变。纯化病毒SDS-PAGE条带与BmIFV蛋白相仿。病毒核酸鉴定为RNA,并可用套式RT-PCR扩增出特异性片段,测序发现片段序列和BmIFV日本坂城株的同源性为99.5%。由此可确定该病毒为BmI-FV,这是我国首次分离到该病毒,暂命名为BmIFV-CHN001。     

家养野猪源猪圆环病毒2型安徽株的分离鉴定及其全基因组序列分析

目的对安徽省临诊疑似PMW S家养野猪病例进行猪圆环病毒2型(PCV2)分离鉴定,并对分离株的全基因组进行克隆与序列分析。方法应用PK-15细胞进行PCV2的分离与增殖,根据PCR、IFA、电镜技术进行PCV2分离株的鉴定,克隆分离株的全基因组,并对序列进行分析。结果获得1株来自安徽家养野猪源PCV2分离株,命名为YZ0901。该毒株全基因组长为1 767 bp,属于PCV2b基因型。与GenBank已发表的国内外参考毒株的同源性介于93.9%~99.2%,与安徽分离毒株彼此之间的同源性介于93.4%~99.5%。结论安徽省家养野猪中存在PCV2感染,分离毒株与家猪源病毒差异不大,PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性,家养野猪源PCV2的基因型与当地PCV2流行株的基因型密切相关。     

两株田间重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定、进化分析及其致病性研究

为了解2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV2)田间毒株重组特征,本研究对两株分离物(HENXX-8、HENJY-2)进行全基因测序、进化分析及毒力测定,并对其全基因序列进行重组分析。结果显示,两个毒株均属于PRRSV 2,两者与其代表株VR-2332的核苷酸相似性分别为85.6%、85.7%;与高致病性PRRSV(HPPRRSV)毒株JXA1、TJ和WUH4株分别为85.7%～85.8%、85.4%～85.5%;与经典毒株CH-1a、HB-2(sh)分别为84.7%～85.7%、84.5%～85.7%;而与所有NADC30类毒株均在90.0%以上。全基因、ORF5及Nsp2序列进化分析结果均显示两个分离物与国内报道的类NADC30毒株遗传距离较近,同处于一个分支。全基因组重组分析结果表明,两个分离毒株存在明显重组现象,且重组模式均以类NADC30毒株为骨架病毒,与HP-PRRSV毒株发生重组。但重组对象不同:HENJY-2是由类NADC30毒株与TJ株发生重组;而HENXX-8则是由类NADC30毒株与WUH4、TJ株发生3毒株间重组。由于重组部位序列缺乏特异性分子标志,因此无法确定与类NADC30发生重组的是HP-PRRSV还是其减毒的疫苗毒株。两株分离物的重组部位与早期分离毒株HENANHEPB、JL580等有所不同,均未涉及到ORF5基因,而是集中在Nsp1～Nsp2以及ORF2a～ORF3区域,主要发生在病毒基因组的靠5'端(30～7 000 bp)和3'端(11 000～13 000 bp)处。对部分重要基因的核苷酸相似性分析结果显示,两个分离株的ORF2a、ORF3基因与HP-PRRSV毒株相似性最高,表明重组病毒的这两个基因可能来自HPPRRSV毒株。致病性试验结果表明,参考毒株HENXC-4的毒力略高于分离毒株HENXX-8,主要表现在体温升高、日均增重降低和肺部病变上。但两个分离物均未引起发病猪死亡。以上结果表明,目前PRRSV2在田间的基因重组事件存在随机性,提示不同毒株在田间的存在会加剧PRRSV重组事件的发生和流行、毒株类型更加复杂,从而增加了临床防控难度。因此,慎重使用活疫苗并持续监测活疫苗毒株在田间的变异动态,对更好防控本病具有一定的临床指导意义。     

三株新城疫广西分离株全基因组序列的测定与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR方法获取了3株广西地方强毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03的全基因组序列,并对其进行了比较分析。此3株病毒的全基因组序列均由15192个碱基组成,与GenBank公布的ZJ1、U.S/Largo/71、Italy/2736/00等7个毒株的全基因组序列长度相同,比LaSota、Clone-30和B1的全基因组序列多出6个核苷酸,此6个核苷酸位于np基因的非编码区内,相对与NDV毒株LaSota、Clone-30和B1序列的1647~1648nt位。通过序列的比较分析,发现GX7/02、GX9/03和GX11/03与ZJ1毒株的同源性较高,而与LaSota、Clone-30和B1等毒株的同源性较低。     

三株新城疫广西分离株全基因组序列的测定与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR 方法获取了3株广西地方强毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03的全基因组序列,并对其进行了比较分析.此3株病毒的全基因组序列均由15192个碱基组成,与GenBank公布的ZJ1、U.S/Largo/71、Italy/2736/00等7个毒株的全基因组序列长度相同,比LaSota、Clone-30和B1的全基因组序列多出6个核苷酸,此6个核苷酸位于np基因的非编码区内,相对与NDV毒株LaSota、Clone-30和B1序列的1647～1648nt 位.通过序列的比较分析,发现GX7/02、GX9/03和GX11/03与ZJ1毒株的同源性较高,而与LaSota、Clone-30和B1等毒株的同源性较低.     

兔出血症病毒（RHDV）WHNRH株的分离鉴定及基因组全序列的测定与分析

从发病长毛兔中分离鉴定了兔病毒性出血症病毒WHNRH株。参考GenBank中已登录的RHDV毒株序列对RHDV WHNRH分离株进行了全基因组序列测定与分析。设计5对扩增区段相互重叠的RHDV特异性引物,扩增除5′和3′末端以外的序列,采用设计锚引物的5′RACE方法以及针对RHDV 3′末端的polyA结构设计引物获得了RHDV WHNRH株的5′和3′末端序列。胶回收各PCR产物,连接pMD 18-T克隆载体,测得RHDV WHNRH分离株的基因组全长为7437nt(不包括polyA),与GenBank公布的全部共6株RHDV全基因序列进行同源性比较分析,同源性在89.0%~97.1%之间,ORF1同源性为89.0%~97.1%,编码氨基酸序列的同源性为95.2%~98.7%;ORF2的核酸苷序列同源性为92.1%~97.7%,编码氨基酸序列的同源性为94.1%~96.6%。     

G Ⅱ.23基因型诺如病毒P蛋白的寡糖结合特征

诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是导致人急性胃肠炎的最重要病原体之一,也是引起食源性疾病暴发的首要病原体。组织血型抗原(Histo-blood groups antigens,HBGAs)是NoVs的受体或宿主易感因子。已有研究表明HBGAs与NoVs的感染和流行高度相关。GⅡ.23是最近报道的NoVs新基因型。为了研究GⅡ.23与HBGAs的结合特征,表达纯化GⅡ.23基因型的P蛋白之后,通过唾液和寡糖结合实验研究其与HBGAs的结合特性,并通过同源结构模拟探索GⅡ.23 P蛋白与糖抗原潜在的对接分子机制,与已经解析的GⅡ.10的P蛋白与岩藻糖的复合物结构进行重叠。结果发现,GⅡ.23 P蛋白可以与B型唾液结合,但不结合A、O^+和O^-非分泌型唾液;P蛋白与H双糖抗原发生结合;分子模拟显示GⅡ.23 P蛋白具有与岩藻糖环结合的类似特征。本研究首次揭示了GⅡ.23 P蛋白与HBGAs受体的结合特征,为深入探索GⅡ.23基因型NoVs的进化、感染以及流行的具体机制提供了基础资料。     

牛血液中一株新型环状病毒的分离与全基因组序列分析

我们从广西壮族自治区哨兵动物牛上采集的血液样本中分离到一株病毒,暂将其命名为广西环状病毒(毒株号:V172/GX/2015)。病毒接种C6/36细胞后可产生明显的细胞病变,表现为细胞聚集、皱缩与脱落。高分辨率琼脂糖凝胶电泳显示,病毒基因组由10节段的双链RNA组成,在凝胶上呈现"3-4-3"的带型特征。通过全长cDNA扩增与高通量测序方法获取V172/GX/2015毒株的全基因组序列。病毒基因组大小为19 889bp,基因节段的大小在3 996bp(Seg-1)至829bp(Seg-10)之间,可编码VP1至VP7等7种结构蛋白以及NS1至NS3等3种非结构蛋白。对环状病毒属保守的VP1、VP3(T2)与VP7(T13)蛋白氨基酸序列分析与系统发育树分析显示,V172/GX/2015与蚊传播环状病毒Yunnan orbivirus、Peruvian horse sickness virus以及Mobuck virus具有较近的亲缘关系,氨基酸序列相似度在31.4%至69.9%之间;V172/GX/2015在系统发育树上形成了一个独立于其它环状病毒的进化分支。本研究首次报道了一种新型环状病毒在牛上的分离与全基因组序列,研究结果将进一步丰富我们对环状病毒属病毒的认知,为开展新型环状病毒的流行病学调查与致病性研究提供基础。