甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

通过对甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶(NA)核苷酸进化趋势的研究,进而探寻2013年新型H7N9亚型禽流感病毒产生的根源。本次研究选取美国国立生物技术信息中心(NCBI)的甲型N9亚型流感病毒的NA序列,采用生物软件ClustalX 2.0和MEGA 6.0建立进化树形图。对其欧亚分支,采用BEAST软件2.1.2和Datamonkey interface在线软件,计算和分析选择压力和进化速率。采用Bioedit软件对NA的氨基酸置换熵值计算并分析。系统进化树表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒可划分至现代欧亚分支之内,并且该分支的每位点每年核苷酸置换速率均值为3.8354×10-3,选择压力dN/dS均值为0.140413。16、19、40、53、81、84、112、256、335、359和401的氨基酸变异位点熵值0.5。研究分析表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒的NA片段基因可能来自甲型N9亚型流感病毒逐步进化的结果,最早可追溯到1996年的A/duck/Siberia/700/1996(H11N9)流感毒株,新型H7N9亚型禽流感病毒来源不是来自外界环境压力引起突变的结果。     

海南省2016-2018年A(H1N1)pdm09亚型流感病毒基因特性分析

2009年A(H1N1)pdm09亚型流感病毒在墨西哥暴发,之后在全世界流行。为了解海南省2016-2018年A(H1N1)pdm09亚型流感病毒流行态势,分析血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)基因遗传进化特征与变异情况,本研究从中国流感监测信息系统获取海南省2016-2018年流感病毒病原学监测数据,选取5家流感监测网络实验室分离鉴定的37株A(H1N1)pdm09亚型流感毒株进行HA与NA基因测序,利用MEGA 10.1.8构建HA与NA基因种系进化树,并分析其氨基酸变异情况。结果显示,2016-2018年共出现3次A(H1N1)pdm09亚型流感病毒活动高峰。2017年10月份以后的分离株(4/8)与2018年大部分分离株(21/22)独立于疫苗株A/Michigan/45/2015聚为一个小支,发生20余处HA与NA氨基酸位点变异。与疫苗株A/California/7/2009(2010-2016)相比,2016-2018年流感病毒分离株在HA基因抗原决定簇上发生7处氨基酸变异并有一个潜在糖基化位点,未发现HA基因受体结合位点变异与NA基因耐药性变异。本研究提示,2016-2018年,A(H1N1)pdm09亚型流感病毒逐步发生规律性进化,氨基酸变异频率有增加趋势,今后应持续加强流感病毒病原学监测,密切追踪A(H1N1)pdm09亚型流感病毒基因变异情况,为科学防控提供理论依据。     

一株达菲耐药的甲型H1N1流感病毒全基因特征分析

目的分析1株甲型H1N1流感达菲耐药病毒株的全基因特征,为指导流感临床治疗与防控提供依据。方法采用鸡胚进行病毒分离,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增其全基因组8个基因片段,测定核苷酸序列,利用生物信息软件拼接全基因组序列,绘制基因进化树并分析重要基因位点变异情况。结果 A/Fuzhou/SWL11609/2013(H1N1)流感毒株的8个节段基因均处于2013-2014年度进化簇中,且与A/California/07/2009(H1N1)疫苗株高度同源,8个基因同源性均在97.4%以上;其HA和NA基因与A/Hubei-Wuchang/SWL1322/2013(H1N1)达菲耐药株同源性最高,分别为100.0%和99.6%;初步判断该毒株未发生重配现象,其重要致病性基因位点未发生变异;NA基因中具有H275Y典型达菲耐药位点特征,缺失一个糖基化位点(N386K),降低了基因结构的稳定性,同时在V241I和N369K的作用下降低了病毒的适应性。结论本次研究的甲型H1N1流感达菲耐药病毒株表现为低致病性流感病毒特征,但具备较好的人传人能力,需进一步加强监测,谨防耐药株的广泛流行。     

鸡源H9N2亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因序列分析

对1996～2001年间自中国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的神经氨酸酶基因(NA),进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性.结果表明,NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.1%～99.8%和95.7%～99.7%,说明NA基因稳定遗传,高度保守.与A/chicken/HongKong/G9/97相比较,发现中国大陆鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶蛋白在其茎部的第63、64、65位点上都有3个氨基酸的丢失,而与中国邻近的韩国、巴基斯坦鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶没有氨基酸的丢失,因此这些部位的氨基酸丢失可初步认为是中国大陆H9N2流感病毒分离株的一个标记.系统进化树分析表明,该8株病毒的NA基因属于相同的进化分支,即A/duck/HongKong/Y280/97-like分支,尚未发现NA基因属于A/quail/HongKong/G1/97-like分支的分离株.中国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化亚分支,说明H9N2亚型禽流感的发生与流行和地域有一定的相关性.     

利用焦磷酸测序技术检测H7N9禽流感病毒NA基因分子标签

本研究旨在建立H7N9亚型禽流感病毒NA基因分子标签的焦磷酸测序检测方法,用于H7N9型禽流感病毒的快速检测和鉴定。通过对公开发表的H7N9亚型禽流感病毒NA基因序列进行比对,发现分离株在NA基因特定区域缺失的15个核苷酸可作为H7N9亚型禽流感病毒NA基因特异性的分子标签。通过设计覆盖此区域的特异性扩增引物和测序引物,建立了H7N9型禽流感病毒NA基因焦磷酸测序检测方法。基于NA基因特定缺失区域建立的焦磷酸测序技术能用于H7N9亚型禽流感病毒国内分离株NA基因的快速检测和鉴定,且具有较好的特异性和重复性。通过对3株H7N9亚型禽流感病毒分离株的检测,表明3株H7N9亚型禽流感病毒的NA基因均存在15个核苷酸缺失的分子标签。本研究建立的H7N9亚型禽流感病毒NA焦磷酸测序检测方法,可用于H7N9禽流感病毒的检测和鉴定。     

一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析

从广东省疑似流感发病猪分离到1株H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Guangdong/01/2005(H3N2)),对其各个基因进行克隆与测序,并与GenBank中收录的其它猪流感、禽流感和人流感的相关基因进行比较,结果表明,HA全基因与广东2003~2004年分离的H3N2猪流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上,与纽约90年代末分离的H3N2人流感毒株同源性在98.5%以上;NA基因与纽约1998~2000年分离的H3N2人流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上;NS基因、M基因的核苷酸序列与H1N1亚型猪流感毒株A/swine/HongKong/273/1994(H1N1)的核苷酸序列同源性较高,分别为97.9%、98.4%,与美洲A/swine/Iowa/17672/1988(H1N1)的核苷酸序列同源性分别为96.7%、97.1%;其他基因的核苷酸序列与H3N2人流感毒株具有很高的同源性。因此,推测其M和NS基因来源于H1N1亚型猪流感病毒,HA、NA及其他基因均来源于H3N2亚型人流感病毒。表明此H3N2亚型猪流感病毒为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒经基因重排而得到的重组病毒。     

A/swine/H1N1流感病毒中国分离株血凝素进化分析

2009年3月以来,甲型H1N1病毒已在全球包括中国造成了巨大的危害,所以利用生物信息技术对其进行研究显得十分必要。从NCBI数据库下载中国大陆境内A/swine/H1N1病毒HA基因核酸序列及其编码蛋白序列,利用MEGA4.0软件对核苷酸编码序列构建系统进化树,利用BioEdit软件对蛋白序列进行比对,分析重要抗原位点变异情况,结果显示2010年在广东流行的病毒,从其他地方传播到广东的,而非早期广东流行的的病毒变异而来。2008年福建,山东,北京等地区的病毒传播比较迅速.这些分析结果阐明了中国大陆境内A/swine/H1N1病毒血凝素(HA)基因的进化关系和变异趋向,对于研究A/swine/H1N1病毒具有重要的参考价值。     

H1N1亚型猪流感病毒广东分离株全基因克隆及其遗传演化分析

为了研究H1N1亚型SIV遗传演化与变异的特性,采用RT-PCR技术分别扩增A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)的8个基因片段,分别将其克隆到pMD18-T载体,进行全基因组序列测定.核苷酸序列测定结果显示:LM株SIV各基因片段均未发现核苷酸插入或缺失现象.HA切割位点处的氨基酸序列序列为IPSIQSR↓G,与高致病性SIV的H1N1亚型毒株的分子特征不符合.HA基因含有6个潜在的N-糖基化位点,4个在HAl的第11、23、87、和276位,增加2个分别在HA2的154和213位点;NA基因不仅在58、63、68、88和146位含有高度保守的N-糖基化位点,而且在44和235位增加2个潜在的N-糖基化位点,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征.核苷酸同源性结果:HA基因与类人谱系的流感病毒分离株有很高的同源性(99%),而其他基因均与古典猪谱系的流感病毒分离株同源性较高(87%～98%).从绘制的各个片段进化树和核苷酸同源性分析结果,可以推测该毒株HA基因可能来源于类人谱系的流感病毒;而其他基因来源于古典猪谱系的流感病毒.     

苏州活禽市场禽流感病毒(H7N9)季节变化及HA、NA、PB2基因系统进化分析

自2013年3月中国首次发现新型禽流感病毒H7N9以来,其于2013-2014年期间发生流行,2015年也有散发性感染。该病毒的流行不仅危及家禽养殖业,还对公共卫生安全造成严重威胁。为调查活禽市场中H7N9的进化史和季节性变化,本研究于2013年7-12月在H7N9主要流行地区之一江苏省苏州市活禽市场采集2 655份鸡、鸭咽拭子样本,对样本中流感病毒核酸进行检测。结果显示,冬季样本中H7N9阳性率显著高于夏季样本,同时发现样本中存在H5、H7和H9亚型毒株之间的混合感染。进一步对H7N9阳性样本的HA、NA和PB2基因序列进行分析,结果表明阳性样本中HA、NA和PB2基因序列与新型H7N9病毒的相应基因序列同源,其在家禽体内传代时也在继续进化。特别是一些样品中PB2基因序列与H5N1病毒PB2基因序列的同源性较高。结果提示,苏州存在一种新型H7N9病毒基因重排的可能性,建议在活禽市场对所有禽流感病毒亚型进行持续监控,从而有助于流感病毒的及时防控。     

流感病毒H7N9病毒样颗粒疫苗的研发

<正>最近,中国出现了由禽源性流感病毒A(H7N9)引起的严重性传染病,为此全球付出努力,来实现候选疫苗的快速研发。目前,非流感病毒A(H7N9)H7亚型流感候选疫苗在面对新近出现的流感病毒A(H7N9)时,其免疫原性低,保护效果差。一种流感病毒A(H7N9)重组候选疫苗,是将A/Anhui/1/2013株的血凝素(HA)、神经氨酸苷酶(NA)和A/Indonesia/05/2005(H5N1)株的基质蛋白1(M1)克     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的:对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1(NS1)基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法:从GenBank获得2006~2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果:经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%~100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%~90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论:为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。     

2013～2014年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析

为分析2013~2014流感监测年度中国大陆地区H3N2亚型流感病毒的抗原性和基因变异情况,本文选择了本监测年度中国分离的H3N2亚型流感病毒,利用标准雪貂抗血清进行抗原性分析,利用Sanger测序法进行病毒基因测序,采用邻位相临法(Neighbor-Joining,N-J)方法进行种系进化分析,分析我国H3N2亚型流感病毒的变异情况,进一步比较其与疫苗株的匹配性。抗原分析显示,本监测年度H3N2亚型流感病毒大部分为疫苗株A/Victoria/361/2011细胞株的类似株(99.6%),但以A/Texas/50/2012鸡胚株为参考抗原,只有15.1%为类似株,仅有11.9%与中国流行株的鸡胚分离株A/Shanghai-Changning/1507/2012抗原性类似。HA基因特性分析显示我国毒株均位于同一大分支,NA基因没有发现与耐药性相关的氨基酸位点突变。总之,2013~2014流感监测年度我国H3N2亚型流感病毒在流行过程中未发生明显变异,但病毒在鸡胚中传代会导致关键氨基酸位点变异。应及时分析并发现我国病毒的抗原性和基因特性变异情况,推选出更适合我国的疫苗株。     

2015年湖南部分地区H9N2亚型流感病毒HA和NA基因遗传进化

我国湖南地区因水禽家禽饲养较多且密集,是流感病毒高发省份。为了监测流感病毒的变异情况,采用RT-PCR技术扩增了10株H9N2亚型流感病毒的HA和NA基因,并进行了序列测定和分析。结果显示,10株分离株均属于欧亚分支中的Y280亚系;HA碱性裂解位点序列均为RSSR↓GLT,为低致病性流感病毒特征;HA受体结合位点234位均为L,具有与人唾液酸α-2,6受体结合的特性;NA蛋白均在颈部 (63–65位) 出现氨基酸缺失,这种缺失能增加流感病毒在哺乳动物中的复制能力。提示H9N2亚型毒株近年有毒力和致病力趋于转强的可能性,因此,要加强对H9N2亚型禽流感病毒的监测,密切关注它的重组趋势。     

用免疫信息学技术设计新型H1N1流感神经氨酸酶抗原表位肽

神经氨酸酶(NA)是一种具有唾液酸酶活性的流感毒粒表面糖蛋白,切断病毒HA与细胞膜上神经氨酸残基之间的连接,使病毒能够从宿主细胞表面释放.检测了新型H1N1流感NA基因核苷酸序列,用免疫信息学方法预测、筛选和鉴定B细胞表位;人工合成NA抗原多肽SE8和RE6,并免疫新西兰兔制备抗血清.两种抗血清具有体外中和新型H1N1流感病毒能力(微量中和实验),而且还具有拮抗血凝释放作用.根据2009年全球毒株NA基因序列检测和比对结果,发现多肽SE8和RE6序列未变异.实验揭示,多肽SE8和RE6可以作为新型H1N1流感候选多肽疫苗.     

广州市两株人感染H5N6禽流感病毒全基因组序列特征分析

H5N6禽流感是重要的人兽共患病,给公共卫生带来严重威胁。为研究人感染H5N6禽流感病毒的基因特征,本文对广州市两株人感染H5N6禽流感病毒进行全基因组序列扩增,应用生物信息学软件分析分子变异和遗传进化特征。结果显示:两毒株各基因片段同源性存在差异,血凝素(Hemagglutinin,HA)基因同源性最高为98.3%,PB2基因同源性最低为85.2%。A/Guangzhou/41641/2014(H5N6)病毒的HA、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)、聚合酶碱性蛋白2(Polymerase basic protein 2,PB2)基因与猫源毒株A/feline/Guangdong/1/2015(H5N6)亲缘关系较近,推测可能起源于共同祖先。两株病毒均为禽源高致病性病毒,HA和NA表面蛋白受体结合位点、裂解位点和耐药位点未发生变异。内部基因重要位点均有不同程度的变异,其中以41641病毒变异较大,并发生PB2蛋白E627K突变。两株病毒均发生与不同亚型病毒之间的重组现象,41641病毒的内部基因分别与H5和H9N2/H7N9发生重组,其中PB2和PB1基因分别与2013年...     

中国历年H3N2亚型人流行性感冒病毒血凝素基因的序列测定及分析

测定了27株中国1968～2000年的人H3N2亚型流行性感冒(流感)病毒分离株HA1基因的核苷酸全序列,其中包括7株流行代表株:A3/Beijing/1/68、A3/Guangdong/243/72、A3/Beijing/39/75、A3/Guangdong/38/77、A3/Beijing/266/85、A3/Beijing/30/95、A3/Shanghai/1/98.阐明了这些流感病毒分离株的基因结构、变异本质、进化发展过程以及这些毒株与其它分离株之间的遗传进化亲缘关系,为应用生物信息学研究流感病毒基因组变异规律等打下了基础.初步的进化分析表明,历年来的人流感病毒H3N2亚型的起源和进化分为两个分支谱系,并在1984/1985年进行了交替转换;且有一部分人的H3N2亚型分离株其HA1核苷酸序列与猪分离株的进化亲缘关系最为接近.     

山东省甲型H1N1流感病毒病原学及基因特性研究

在2009~2010年监测年度开展甲型H1N1流感病毒学监测并进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况。采集了17 126份发热患者的鼻、咽拭子标本,采用逆转录实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)进行核酸检测,其中甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性4004份,总阳性率为23.38%。对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序。利用DNAStar软件对序列进行同源性分析发现与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株HA、NA基因同源性分别为96.9%~99.3%和99.1%~99.6%;利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析发现,与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株有21个血凝素基因的氨基酸发生替换,其中11个氨基酸位点位于抗原决定簇区,一个糖基化位点发生改变;有16个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,一个糖基化位点发生改变;未发生神经氨酸酶蛋白275位H→Y的替换。结果显示山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变,所有病毒均对达菲类药物敏感。     

近20年中国部分地区鸡源H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传演化及其变异频率北大核心CSCD

【目的】通过比较不同时期的H9N2亚型禽流感流行毒株HA基因的分子特征和变异频率,揭示免疫压力下病毒的遗传演化趋势。【方法】选取源于课题组的40株鸡源H9N2毒株,以及从Gen Bank下载的136株中国鸡源H9N2流行毒株和7株经典毒株的序列,利用Lasergen 7.1和MEGA 5.1等软件,对其HA基因进行系统演化、分子特征和变异频率分析。【结果】系统发育分析表明,近20年的鸡源H9N2流行株分属于BJ94、Y280和S2等谱系,优势流行株的分布与年代密切相关。氨基酸序列比较显示,H9N2病毒不同谱系之间具有各自的特征,且存在着明显的氨基酸变异积累。以Ck/BJ/1/1994 HA基因为参照,1994–2014年间,H9N2流行株核苷酸和氨基酸的年均进化率分别为5.73×10^(–3)和4.25×10^(–3)。其中,2011–2014年的核苷酸(氨基酸)年均进化率为6.35×10^(–3)(5.32×10^(–3)),明显高于2006–2010年5.22×10^(–3)(3.70×10^(–3)),更显著高于疫苗推广初期1999–2005年的0.74×10^(–3)(0.50×10^(–3))。【结论】H9N2疫苗株和流行毒株的不匹配是病毒变异频率加快的重要原因。     

云南省2009～2014年甲型H1N1流感病毒HA及NA基因特征分析

了解云南省2009~2014年甲型H1N1流感病毒的流行趋势,研究HA和NA基因进化特征。对云南省近6年来上报的流感监测病例数据进行病原谱总结,挑选出23株甲型H1N1流感毒株进行HA及NA基因分析。利用MEGA 5.0软件对测序结果构建进化树分析基因同源性。2009~2014年云南省共监测到4次甲型H1N1流感流行高峰,核酸检测结果中甲型H1N1流感占检出总量的28.8%。测序结果显示,HA与NA基因均分为3个类群,检测到一株具有H275Y突变位点的毒株。甲型H1N1流感是导致本省流感流行的重要亚型之一,2009~2014年间分离的毒株主要有Goup1、Gourp7和Gourp6三个支系,绝大部分甲型H1N1流感毒株仍对神经氨酸酶抑制剂敏感。     

广西鸭源H6N6亚型禽流感病毒NA的序列分析

2009年至2014年间我单位在广西南宁、防城港和梧州三市活禽交易市场进行流行病学调查时,在鸭咽喉和泄殖腔中分离到10株H6亚型禽流感病毒(AIV)毒株。为了解这10株病毒的神经氨酸酶基因(NA)的分子特征和差异,我们运用RT-PCR对这10株H6亚型禽流感病毒的NA基因进行了扩增、序列测定及分析。结果显示,所分离的10株病毒均为H6N6亚型流感病毒。序列同源性分析结果表明A/DK/NN/6121/2013株的NA基因与其他9株NA基因差异性较大,差异性达到5.4%~5.9%,其余9株之间相似性在97.9%~100%;南宁与防城港、南宁与梧州以及梧州与防城港毒株相似性分别为94.5%~100%、94.1%~98.1%和97.8%~98.5%,这些数据表明不同毒株呈现一定的地域性差异。氨基酸序列分析发现10个毒株NA基因上潜在的糖基化位点也有所不同,表明这些毒株有异源性。遗传进化分析表明10株NA基因片段均属于欧亚谱系的禽源演化分支,除了南宁市的DK/NN/6121与福建相应毒株遗传进化关系较近外,其他9株与越南的相应毒株相互之间遗传进化关系都很亲近,且与越南A/duck/Vietnam/LBM235/2012(H3N6)株的NA基因存在很近的遗传关系,推测它们之间的基因可能存在基因交流;同时发现与台湾和韩国等的毒株关联不大。