云南蚊虫中阿卡斑病毒的分离和鉴定

为掌握云南省德宏州芒市和瑞丽市蚊媒病毒分布状况,2010年8月用诱蚊灯采集蚊虫17种2 149只,用金黄地鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)培养法分离病毒,阳性分离物用阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)S和M片段特异性引物的RT-PCR法鉴定。从采集蚊虫中分离到能引起BHK-21细胞病变和致乳小白鼠发病死亡的2株病毒,其中DHL10M110株分离自瑞丽市迷糊按蚊(Anopheles vagas),DHL10M117株分离自芒市三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)。RT-PCR扩增获得S片段的702bp序列和M片段的456bp序列,系统进化树分析表明DHL10M110和DHL10M117株与肯尼亚和澳大利亚AKV分离株进化关系较远;与日本、韩国和中国台湾的AKV分离株亲缘关系较近,但云南株形成一个独立的小分支。2株新分离病毒的S片段与中国台湾CY-77株的核苷酸(96.6%和96.7%)和氨基酸(99.6%和100%)同源性最高;M片段与日本Iriki株的核苷酸同源性最高(93.2%和93.6%),与中国台湾CY-77株氨基酸同源性最高(99.6%和100%);与肯尼亚MP496株核苷酸(69.7%和70.0%)和氨基酸(91.0%)同源性最低。本研究证实云南省德宏州存在AKV的流行,与亚洲流行株具有较近的亲缘关系。三带喙库蚊和迷糊按蚊可传播该病毒。     

三带喙库蚊体内猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

【目的】调查猪场蚊虫是否能携带猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒。【方法】采集发生PRRS疫情的3个养猪场蚊虫样本,采用RT-PCR方法检测PRRS病毒核酸,取阳性蚊虫样本接种Marc-145细胞进行病毒的分离培养,以间接免疫荧光抗体技术和分子克隆技术进行病毒的鉴定。【结果】 养猪场内的蚊虫主要有三带喙库蚊Culex tritaeniorhychus、凶小库蚊Culex modestus、中华按蚊Anopheles sinensis和骚扰阿蚊Armigeres obturbans,其中三带喙库蚊占86.76%;以PRRS病毒N基因引物进行扩增,三带喙库蚊样本呈现阳性反应,而其他蚊种均为阴性。在蚊虫接种的Marc-145细胞中可见细胞融合和空泡形成等细胞病变效应;用抗PRRS病毒N蛋白抗体和羊抗猪IgG(H+L)-FITC进行间接免疫荧光染色,感染细胞呈现黄绿色荧光;以NSP2基因引物进行RT-PCR扩增、克隆与测序,发现库蚊源病毒与相应猪场猪源病毒中相应基因的序列具有较高同源性。【结论】 三带喙库蚊为猪舍优势蚊种,并能携带猪繁殖与呼吸综合征病毒。     

2014年甘肃省部分地区蚊虫及蚊媒病毒调查

为调查甘肃省部分地区蚊虫及蚊媒病毒的种类及分布,本课题组2014年在甘肃省酒泉市和陇南市地区共采集蚊虫4 412只.酒泉市共采集蚊虫2属3种2 833只,其中背点伊蚊(Aedes dorsalis)2 665只(94.1％)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)150只(5.3％)、淡色库蚊(Culex pipiens pallens)18只(0.6％);陇南市共采集2属2种1 579只蚊虫,其中淡色库蚊1 451只(91.9％)、中华按蚊(Anopheles sinensis)128只(8.1％).经实验室常规处理后,将蚊虫标本分为96批,接种于C6/36、BHK和Vero细胞,进行病毒分离和多种病毒基因特异性扩增检测.结果显示,96批蚊虫标本在3种细胞中均未出现细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),在18批蚊虫标本研磨液中检测到辽宁病毒(Liaoning virus,LNV)基因阳性.病毒核苷酸序列的遗传进化分析显示,在甘肃省检测到的辽宁病毒与此前在我国新疆维吾尔自治区发现的辽宁病毒亲缘关系最近.     

三带喙库蚊中分离的西藏环状病毒全基因序列测定及分析

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)是环状病毒属中的新成员,首次分离自中国西藏自治区的圆斑按蚊,本研究首次对从三带喙库蚊标本中分离到的西藏环状病毒(HN11121株)进行全基因组序列测定和分子遗传进化分析。结果显示除第2节段以外,三带喙库蚊分离的HN11121病毒株与从圆斑按蚊分离的西藏环状病毒原始分离株(XZ0906)第1~10节段核苷酸和其编码的氨基酸序列长度相同,核苷酸和氨基酸同源性分别为70.3%(S6)~98.7%(S5)和79.8%(S6)~99.8%(S10);而HN11121病毒株与XZ0906病毒株第2节段核苷酸长度分别为2 850bp和2 838bp,分别编码950和946个氨基酸,核苷酸和氨基酸同源性分别为55.8%和47.1%。病毒VP2蛋白氨基酸位点差异结果显示从三带喙库蚊分离的HN11121病毒与从圆斑按蚊分离的XZ0906相比存在390个氨基酸差异位点。基于HN11121病毒株VP1基因和VP3基因核苷酸序列的系统进化分析结果显示HN11121属于环状病毒属西藏环状病毒,但是从三带喙库蚊分离的HN11121病毒与在圆斑按蚊分离的西藏环状病毒原始分离株(XZ0906)处在不同的进化分支。以上结果提示,从三带喙库蚊分离的西藏环状病毒(HN11121)与从圆斑按蚊分离的西藏环状病毒在病毒基因组和病毒基因组分子遗传进化均存在较大差异,鉴于三带喙库蚊是我国乙脑病毒的主要传播媒介,同时该蚊种也是我国南方广泛存在的蚊虫种类,因此加强三带喙库蚊中西藏环状病毒监测对于了解西藏环状病毒的生物多态性具有重要意义。     

辽宁发现库蚊黄病毒

2011年从辽宁省丹东地区蚊虫样品中分离到6株病毒,采用逆转录-聚合酶链式扩增(RT-PCR)检测方法,结果黄病毒属通用引物和库蚊黄病毒特异性引物均为阳性。6株病毒核苷酸序列经基因库(GenBank)比对后,证实6株病毒为库蚊黄病毒,为我国首次报道。将病毒NS5基因和E基因核苷酸序列与GenBank中10株库蚊黄病毒参考毒株核苷酸序列进行比较,并构建遗传进化树,结果显示本次分离的6株病毒与美国和日本的毒株亲缘关系较近。     

广东省三株蚊媒黄病毒的鉴定和系统进化分析

为了解广东省蚊媒病毒的种类和分子特征,本研究对从蚊子中分离的三株黄病毒提取病毒核酸并进行二代测序,经序列拼接和比对,基因组序列中缺失的gap通过RT-PCR进行扩增填补。用MEGA软件登录GenBank下载黄病毒代表株序列并绘制进化树,同时用ClustalW2软件与新毒株进行氨基酸同源性比对和编码框序列的分析。结果显示利用二代测序技术获得了三株病毒基因组序列的96.35%～98.26%,并用RT-PCR成功补齐所有gap,序列比对显示其中一株与黄斑库蚊病毒核苷酸和氨基酸同源性98.51%,两株病毒与广平病毒的核苷酸同源性分别为97.30%和89.78%。三株病毒都属于黄病毒家族中的未分类黄病毒或昆虫特异性黄病毒,编码区序列中C蛋白的同源性最低,NS5的同源性最高。本研究发现的三株蚊媒黄病毒中,库蚊黄斑病毒在国内为首次鉴定;两株广平病毒核苷酸同源性存在较大差异,可能存在不同基因亚型。     

中华按蚊的幼虫绿色和幼虫褐色品系

蚊虫的幼虫体色突变品系已在淡色按蚊(Anopheles albimanus)、斯氏按蚊(An.stephensi)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)和三带喙库蚊(Culex tritaeniorhychus)等许多蚊种中被分离出来。这些遗传变异品系的发现对研究蚊虫的变异性和遗传性及蚊虫和蚊媒疾病的防治有着重要的价值。在中华按蚊(Anopheles sinensis)种内至今未见关于体色遗传变异类型的报道。作者于1987—1988年在上海中华按蚊种群中,成功地分离出幼虫绿色和幼虫褐色两个品系,现报道如下。     

2018年甘肃省平凉市流行性乙型脑炎病毒的分子特征

为研究甘肃省2018年蚊虫携带流行性乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)的分子特征,2018年7月上旬在甘肃省平凉市4个县采集蚊虫标本,采用实时荧光定量RT-PCR方法开展乙脑病毒筛查;通过高通量测序方法对乙脑病毒基因扩增阳性蚊虫标本进行深度测序研究.结果显示,本次调查在4个县共采集蚊虫1800只,均为三带喙库蚊,分36批研磨和检测.定量RT-PCR结果显示10批(27.8％)蚊虫样本呈乙脑病毒基因扩增阳性.对10批样本进行高通量测序共获得59.7 M读序,其中5.3 M(8.9％)条读序能够比对到病毒基因组数据库上,经注释属于14科15属28种病毒.在其中7批样本中检出乙脑序列共1357条,基因组覆盖度为9.5％-83.1％.系统进化分析显示甘肃省2018年采集的三带喙库蚊中乙脑病毒为基因Ⅰ型.     

中国国内首次发现Nam Dinh病毒

2009～2011年,课题组在深圳市龙岗区的致倦库蚊标本中检测到我国首株Nam Dinh病毒(Nam DinhVirus,NDiV)。本研究通过细胞培养、SYBR Green I实时定量荧光RT-PCR和RT-PCR方法对深圳NDiV的细胞易感性和分子进化特征进行分析。结果发现4批致倦库蚊标本可以引起C6/36细胞病变。4株深圳分离株的SYBR Green I实时定量荧光RT-PCR检测结果均出现"S"型扩增曲线与特异性的熔解曲线。对分离株的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因与部分ZmHel1(Zn module+Superfamily 1 Helicase)基因进行扩增均可以在2%琼脂糖电泳显示到目的条带。4株深圳分离毒株的RdRp基因核苷酸和氨基酸序列与越南代表株NDiV(02VN178)的同源性均达99%以上。系统进化树分析表明,4株深圳NDiV株与越南NDiV代表株的亲缘性最近,属于同一个进化分支上。据文献检索表明,本文发现的NDiV为国内首次报道。     

中国首次分离到Kadipiro病毒

在云南省西北部地区进行的虫媒病毒调查中,从三带喙库蚊、中华按蚊和骚扰阿蚊中分别分离到5株病毒。全部病毒在C6/36细胞上产生细胞病变,而在BHK21细胞不产生细胞病变;电子显微镜观察可见病毒颗粒呈球形,直径约70nm(n=7),无包膜、表面存在明显刺状突起;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示分离的病毒为12节段双链RNA病毒,病毒基因组带形呈6-5-1分布;用Kadipiro病毒的特异性引物可以扩增到目的条带,基因组第12节段全长758nt,与Kadipiro病毒原型株JKT-7075的同源性为90%,遗传进化分析显示在云南蚊虫分离的5株病毒均为呼肠孤病毒科(Reoviridae)东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus)Kadipiro病毒。本文为我国Kadipiro病毒分离的首次报道。     

单个蚊体全脂的快速提取与测试方法

蚊虫的脂肪是提供能量的主要来源。研究单个蚊体脂肪的快速提取与测试方法,对进一步探讨蚊虫越冬机制及其冬期脂肪变化具有一定的参考价值。作者参考Van Handle(1985)所介绍方法对三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus不同发育阶段体内脂肪含量及其变化进行了测试,在试剂配制(氯仿甲醇液为2:1)、加热、快速冷却等方面作了改进,并用烤干保存标本与单个标本测试,对现场保存标本以及越冬蚊脂肪测试比较简便实用。仪器为上海分析仪器厂生产的751G型分光光度计,先制作标准曲线,然后提脂进行测试。经测试所得,每头三带喙库蚊四龄幼虫体内全脂含量…     

温度与光照对三带喙库蚊自育性影响的初步观察

三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus Giles为流行性日本乙型脑炎痫毒的重要媒介,对其自育性的研究有助于媒介生物学的研究。关于蚊虫自育性国外已育较多报告(Laurence,1964;Spielman,1971;Trpis,1977)。近年来,我国也发现白纹伊蚊Aedes albopictus Skuse(崔可伦,1982)与东乡伊蚊     

尼日利亚 Akwa Ibom 洲Uyo市郊传媒蚊虫的繁殖和流行区的确定

蚊虫是寄生虫病的主要传播者。为确定传病媒介蚊虫在Uyo郊区的繁殖和流行地,从1999年5月到2000年1月在208个繁殖地进行了取样,从144个地点用滤网取到了5844只蚊虫幼体。采集到的4种蚊虫是致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)成虫604只(43．5％),冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)357只(26．1％),一种按蚊(Aedes uegypti)208只(25．5％)和非洲曼蚊(Mansonia africana)101只(7．4％)。监测了蚊虫种群的时间变化,发现5月份～10月份的丰度高于11月份～1月份,幼体表明了同样的趋势,但比成体提前1～2个月。卡方检验表明,除了非洲曼蚊以外,其它3种蚊虫数量与混凝土水槽、土坑和居民区伦共环境之间的相关显著。     

稻田养鱼灭蚊效果的观察

广大的水稻田地,一直是蚊类孳生的良好环境,根据书本及文献上的记载,在我国约有22种蚊类能孳生在稻田之中,其中按蚊有中华按蚊(Anopheles hyrcanus sinensis)等16种,库蚊有二带喙库蚊(Culex bitaeniorhynchus)等5种,以及一种刺扰伊蚊(Aedes vexans)。     

二带喙库蚊和中华库蚊夜间活动

二带喙库蚊(Culex bitaeniorhynchus Giles,1901)和中华库蚊(C.sinensis Theobald,1903)的夜间活动情况,国内尚无报告。作者等曾在湖北均县作过观察。结果如后。二带喙库蚊:整夜均有活动,并有黄昏后与黎明前的活动高峰。但后者远不及前者为高(见表)。各月夜间活动不甚一致。但仍可看出蚊虫多时则有黎明前活动高峰,蚊虫少时,则无黎明前高峰出现。各月黄昏后高峰出现的迟早与日落有一定的关系。不同月相对二带喙库蚊的夜间活动有较明显的影响。即在上弦月时上半夜蚊虫活动频繁,满月夜时全夜均有一定数量的蚊虫活动,下弦月时则下半夜蚊虫活动…     

WS-I型灭蚊涂料对三种常见蚊虫的敏感性测定

WS-I型灭蚊涂料对防制淡色库蚊、家蝇等的敏感性已有报道。但对南方夜间常见侵入室内的中华按蚊(Anopheles sinensis)、致倦库蚊(Culex pipiens fatigans)和三带喙库蚊(Culex tritaeniorhychus)的敏感性及对不同状态致倦库蚊的敏感性如何尚未见报道,为此于1987年6月作了实验,现将结果报道于后:WS-I型灭蚊涂料(主含杀灭菊酯),由本地黄沙河灭蚊涂料厂提供;吸血成蚊均捕自牛房,未吸血致倦库蚊为实验室羽化;用“WHO”接触筒,将涂料按每平方0.33公斤用量涂于新华Ⅰ号滤纸上待干后进行测定,吸血蚊以胃血谢拉氏Ⅲ—Ⅳ期、未吸血蚊以5%葡萄糖水…     

云南省4种伊蚊的乙型脑炎病毒分离物的研究

在云南省西南边境9县市捕获伊蚊属雌性成蚊16种19367只,用细胞法和乳鼠法分离病毒.从185批6491只白纹伊蚊中分离到病毒2株,从50批1605只剌扰伊蚊中分离到病毒2株,从23批772只窄翅伊蚊中分离到病毒2株,从4批103只阿萨姆伊蚊中分离到病毒1株.其它12种共10396只伊蚊的病毒分离物为阴性.分离到的7株病毒经免疫荧光、酶免疫、血凝抑制和中和试验鉴定,均为乙型脑炎病毒(JE virus).白纹伊蚊是野外竹林的优势蚊种.分析认为白纹伊蚊在当地乙型脑炎病毒保存和传播中起重要作用,刺扰伊蚊、窄翅伊蚊和阿萨姆伊蚊亦可参与该病毒的传播.     

实验感染的三带喙库蚊和来亨鸡体内西尼罗病毒的分离与鉴定

采用C6/36细胞培养分离活病毒、间接免疫荧光染色检测病毒抗原、RT-PCR扩增病毒基因片段和PCR产物测序等方法,对实验感染的三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus和来亨鸡血液样本中的西尼罗病毒进行分离和鉴定。结果表明,接种实验感染蚊虫研磨液和来亨鸡血液样本的C6/36细胞出现细胞融合、空泡形成的病变效应; 用西尼罗病毒抗血清进行间接免疫荧光染色,感染病毒的细胞呈现黄绿色荧光,为阳性反应; 采用3对不同引物的RT- PCR体系扩增分别出现预期的408 bp、498 bp和559 bp的基因片段,序列测定证实扩增序列与实验所用毒株相应的基因序列基本相同。从而证实实验感染三带喙库蚊和来亨鸡体血液内的西尼罗病毒与实验感染所用的西尼罗病毒Chin-01株一致。     

应用气相色谱法鉴别淡色库蚊与致倦库蚊

从70年代以来,应用气相色谱法分析医学昆虫表皮烃类碳的波形,能有效地鉴别复组的亲缘种类(sibling species),包括蚊、蚋、釆釆蝇等重要传病媒介,已成为昆虫的化学分类法(Carlson, 1984; Phillips & Milligan, 1986)。本文试用气相色谱法鉴别尖音库蚊(Culex pipiens Complex)的淡色库蚊(Culex pipiens pallens)北京株、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的武汉株和广州株。