γ射线对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶的影响 一、酶活力的比较研究

用大鼠、小鼠及狗作为实验动物进行辐射对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力影响的比较研究。在离体实验中,用9700或97000拉德照射大鼠及小鼠的肝素抗凝血,可观察到红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力轻微减低,而在整体实验中却得到以下的不同结果: 1.用400、600及700拉德分别照射大鼠,均可使酶活力下降。400或600拉德照射后酶活力下降至一定时日可恢复至照射前水平,但700拉德照射后酶活力一直下降且始终未恢复。照射后大鼠酶活力的抑制与恢复程度与辐射损伤的轻重有关。2.以800、900和1000拉德的剂量分别照射小鼠后,酶活力无明显变化。经700或1200拉德照射后第1天,狗的红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力较照射前显著下降,而且以后各日,一直处于低的水平。     

产气肠杆菌菌体内核苷磷酸化酶的诱导表达

目的:阿糖腺苷(Ara-A)是一种广谱抗病毒药物,临床上用于治疗多种病毒性疾病.同时也是合成阿糖腺苷单磷酸(Ara-AMP)的重要原料.本课题旨在寻找一种高效酶法生产嘌呤类阿糖核苷的方法.方法:以产气肠杆菌完整细胞为酶源,研究产气肠杆菌菌体培养条件对核苷磷酸化酶的影响及其诱导性.结果:胸苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶均可被多种核苷、核苷酸甚至碱基诱导.胞苷或胞苷酸的添加量为15-20mmol/L,诱导时间在0-8小时均可.经胞苷和胞苷酸诱导的菌体可使酶反应时间缩短6倍,大大提高了反应效率.经诱导的菌体,在反应后仍保持较高的核苷磷酸化酶活力;而未经诱导的菌体,一次反应后即丧失大量的酶活力.结论:核苷磷酸化酶的活性可以通过诱导而提高,以此优化阿糖腺苷的生产.     

枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶的纯化及酶学性质研究

目的：对枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化及酶学性质研究。方法：经加热、硫酸铵盐析和SephadexG-100凝胶过滤,对枯草芽孢杆菌TM903中的嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果：酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7．5,在30-50℃时热稳定性较好;K^＋对该酶有激活作用,而Na^＋、ca^＋、Mg^＋、Mn^＋等金属离子对该酶有抑制作用;Km值为2．11mmol／L,Vmax值为0．84mmol／（min·L）。结论：分离纯化了枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶,并研究了其酶学性质,为利巴韦林的发酵工艺优化提供了重要的酶学理论基础。     

乙酰短杆菌中核苷磷酸化酶的性质研究

目的：以乙酰短杆菌完整细胞为酶源,研究不同条件下核苷磷酸化酶的性质。方法：将乙酰短杆菌湿茵体置于不同保藏温度及在不同种类缓冲溶液中考察其稳定性;在有或无核保护下核苷磷酸化酶对热的稳定性;并设计核苷的磷酸解反应或合成反应,测定核苷磷酸化酶的活力及酶促反应的袁观米氏常数。结果：乙酰短杆菌中的核苷磷酸化酶经低温保藏可以保持较长时间的稳定性;茵体在60℃处理1小时即失去核苷磷酸化酶的活力,但是添加胸腺嘧啶有明显的保护作用;茵体中核苷磷酸化酶的合成能力明显大于磷酸解能力;对尿苷和5-甲基尿苷的表观米氏常数和最大反应速率分别为16．7、11．4mm01／L,0．0063、0．0041mmol／L．min。结论：含核苷磷酸化酶的乙酰短杆菌完整细胞作为酶源,在低温下可以长时间保藏,反应中的碱基对核苷磷酸化酶的抗热性有益,该菌种可以作为工业上核苷磷酸化酶的来源。     

嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶的融合表达及酶法合成嘌呤核苷类产物

将嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶进行融合,提高生物酶法催化合成克拉屈滨等嘌呤核苷类产物的产率.设计不同的刚性、柔性连接短肽(Linker),将嘧啶核苷磷酸化酶EcUP与嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP连接融合,考察酶融合蛋白的可溶性表达与活性情况.使用EEEEEEKKK短肽连接的融合蛋白EcUP-L4-AmPNP可溶性表...     

假交替单胞菌XM2107嘌呤核苷磷酸化酶基因克隆表达、重组蛋白纯化及酶学性质

【目的】嘌呤核苷磷酸化酶(PNP,EC.2.4.2.1)在酶法合成核苷类药物及中间体中具有广泛应用。本文研究的目标是,获得极地嗜冷菌假交替单胞菌Pseudoa lteromonas sp.XM2107嘌呤核苷磷酸化酶编码基因,并对该酶酶学性质进行研究,以考察该酶在核苷类中间体及药物合成中的潜在应用价值。【方法】利用同源序列PCR技术从Pseudoa lteromonas sp.XM2107基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶基因,测序获得编码序列。将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达以及金属螯合层析纯化,对其酶学性质进行初步研究。【结果】经过测序获得了该酶编码基因序列,全长702 bp,共编码233个氨基酸,大小为25 kDa,Genbank登录号为GQ475485。酶学性质研究发现,该重组酶最适反应温度为50℃,最适酶促反应pH为7.6(25 mmol/L磷酸盐缓冲液),最适酶促反应底物为肌苷(Km值0.389 mmol/L,37℃),且对底物腺苷和鸟苷也有磷酸解活性,在普通温度下具有较高催化活性和较好热稳定性。【结论】来源于Pseudoa lteromonas sp.XM2107的嘌呤核苷磷酸化酶在普通温度条件下具有较高的催化活性及良好热稳定性性质,在核苷类中间体和药物合成中具有较广泛的应用价值。     

人参辅酶Q_(10)防晒霜对紫外线损伤小鼠的保护作用

目的研究人参辅酶Q_(10)防晒霜对紫外线损伤小鼠的保护作用。方法 36只小鼠随机分组,皮肤脱毛后分别涂抹相应霜剂,正常对照组不做任何处理,其他组进行紫外线照射,连续8周后,小鼠眼球取血处死进行指标检测。结果与正常组小鼠比较,模型组小鼠皮肤粗糙有皱纹、且角质层脱落,T-SOD与GSH-Px活力均明显下降,白细胞数与MDA含量明显增高(P0.05);与模型组比较,人参辅酶Q_(10)防晒霜组小鼠皮肤光滑、角质层没有脱落,T-SOD活力、红细胞与血红蛋白含量上升,白细胞数量、MDA含量与明显下降(P0.05),阳性对照组小鼠皮肤光滑、角质层没有脱落,GSH-Px活力上升,白细胞数量、MDA含量下降(P0.05)。结论人参辅酶Q_(10)防晒霜具有抗紫外线损伤的作用,其预防效果与甲氧基肉桂酸辛酯辅酶Q_(10)霜剂相当。     

假单胞杆菌D-海因酶的纯化及酶学性质

D-海因酶是工业上生产D-型氨基酸的关键酶,用热变性,硫酸铵沉淀及Sepharose Q fast flow,Phenyl-Sepharose fast flow,Superose 12等柱层析步骤从pseudomonas2262菌体中分离纯化了该酶,纯化倍数约为60,活力回收约为16%.该酶为同源二聚体,分子量约为109kD,亚基分子量约为53.7kD,反应最适pH为8.0,最适温度为70℃,在pH6.0～10.0和温度60℃以下稳定,该酶对巯基试剂敏感,大多数二价金属离子如镁、锰离子等能促使酶活提高,但高浓度锌离子能抑制酶活,以二氢尿嘧啶为底物的米氏常数Km=2.5×10-2mol/L.该酶的N末端10个氨基酸残基依次为MDKLIKNGTI.     

固定化β淀粉酶的制备及其性质

对β-硫酸酯乙飘基苯胺(SESA)与环氧氯丙烷交联琼脂糖反应,制得对氨基苯砜乙基(ABSE)交联琼脂糖,经重氯化后与β-淀粉酶偶联制成固定化酶。研究了载体的苯胺基含量、PH)、巯基乙醇等因素对酶偶联反应的影响。尤其是巯基乙醇的存在,可使固定化酶活力明显提高。固定化酶活力可达120u／ml,活力回收为38％,相对活力为45％。固定化β-淀粉酶的最适pH和最遗温度与自然酶相似,以可溶性淀粉为底物时,固定化酶的米氏常数是自然酶(Km=0．0057(％))的8倍。将固定化酶装柱,连续水解可溶性淀粉,在45℃下连续操作;50天后,酶活力未见下降,在50℃下28天后,还保留活力50%左右。     

人参皂苷Rb3糖基水解酶的纯化及其反应特性

人参皂苷Rb3是三七茎叶皂苷的主要成分。为了充分利用廉价的三七茎叶皂苷,该研究以微生物Aspergillus sp. P90r菌为对象,综合运用生物转化的方法,经过提取、分离纯化和酶活力测定等步骤,最终以确定酶反应途径的方式得到了所产的特异性人参皂苷Rb3糖基水解酶的相关性质和动力学等反应特性。结果表明:该酶比Absidia sp. GRB3-X8r菌产酶活力高15%~25%,SDS-PAGE电泳结果测得分子量约为65.6ku,纯化后酶蛋白的含量为0.237 mg·mL~(-1),蛋白比活力可达到169 U·mg~(-1),纯化倍数为13.70,回收率为9.39%。人参皂苷Rb3糖基水解酶在pH=5.0的偏酸性环境下酶活力很高,最适反应条件:pH=3.0~5.0,温度45℃,其中在pH=4.0~6.0范围内相对稳定。该酶在20 min时进入混合级反应,酶反应米氏常数Km值为8.77 mmol·L~(-1),V_(max)为57.44 mmol·L~(-1)·h~(-1),在60 min时反应速度达到最大,Vmax趋于稳定,为66.63mmol·L~(-1)·h~(-1)。通过对酶的催化特性研究表明,该酶先水解Rb3的20-O-木糖基,其次水解3-O-葡萄糖基,最终催化反应产物中有F2和C-K生成。综上结果,微生物Aspergillus sp. P90r菌酶具有能水解人参皂苷Rb3木糖基和葡萄糖基的特异性。     

驱除侵袭大质粒pINV对福氏2a志贺氏杆菌2457T影响的比较蛋白质组学研究

将福氏志贺氏杆菌2a 2457T及其驱除侵袭大质粒pINV的菌株培养至对数生长中期,制备了全细胞蛋白质。用双向电泳分离两种细胞蛋白质混合物并进行比较,找出差异点,这些点经过胶内酶切后进行MALDI_TOF质谱鉴定。每个蛋白质点的肽指纹图谱都在福氏志贺氏杆菌2a 2457T株的蛋白质数据库用Mascot进行检索,共发现了10个差异表达的蛋白质。结果显示驱除大质粒后几个参与核酸代谢途径的酶表达量有所上升。其中胞啶/脱氧胞啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和尿嘧啶核苷磷酸化酶表达量的上升可能造成尿嘧啶和尿（嘧啶核）苷合成的增加。     

过表达腺苷生物合成正相关基因GlPNP提高灵芝腺苷的含量

【背景】灵芝被纳入我国“药食同源”试点名单,腺苷作为其主要活性物质之一,在免疫调节、抗炎、抗癌等方面发挥着重要作用。【目的】调控腺苷生物合成关键酶基因的表达来提高灵芝腺苷产量。【方法】将不同培养时间阶段腺苷合成酶基因(包括5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶GlATIC、嘌呤核苷磷酸化酶GlPNP、腺苷激酶GlADK)的表达量与腺苷含量相关联,筛选出与灵芝腺苷含量呈正相关的关键酶基因。克隆关键酶基因并在灵芝中过表达,探究关键酶基因过表达对灵芝腺苷积累的影响。【结果】GlPNP的表达与灵芝腺苷含量呈正相关。GlPNP的cDNA全长为969 bp,预测GlPNP蛋白的相对分子量为34.6 kDa,呈三聚体的四元结构。研究结果表明,过表达菌株中GlPNP的表达量在第4天比野生型菌株(WT)上调了2.9-3.9倍,与含空载体的菌株(CK)相比,腺苷含量分别提高了78%和63%。【结论】过表达嘌呤核苷磷酸化酶是提高灵芝腺苷产量的一种有效手段。     

枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶酶学性质研究及在利巴韦林酶法合成中的应用

利用PCR技术从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶的两种基因deoD和punA,构建工程菌并采用金属螯合层析纯化PNP₇₀₂和PNP₈₁₆,酶学性质研究表明:二者具有一致的最适反应温度(60℃)和最适反应pH值(7~8),PNP₈₁₆磷酸解肌苷的催化效率(k_cat/K_m)比PNP₇₀₂高出11.12倍。底物特异性试验表明:PNP₇₀₂为高分子量的六聚体,而PNP₈₁₆为低分子量的三聚体。分别以纯化酶和工程菌菌体为酶源,以肌苷或鸟苷为核糖基供体,TCA(1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺)为底物,酶法合成核苷类抗病毒药物利巴韦林,PNP₈₁₆和工程菌XL-Blue(pPNP₈₁₆)较PNP₇₀₂和工程菌XL-Blue(pPNP₇₀₂)具有更高的催化速度和底物转化率,表明来源于微生物的低分子量的三聚体PNP在核苷类药物和中间体微生物酶法合成中具有更高的应用价值。     

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质的初步研究

本研究以中华绒螯蟹内脏为材料,经过硫酸铵沉淀分级分离、两次DEAE-32离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为4490.79U/mg、纯化倍数为28.07倍的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂。酶分子中各亚基的分子量分别为121.219、8.63和73.48 kD,等电点为4.5。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,进行酶催化底物水解的反应动力学研究,结果表明：酶催化底物反应的最适pH为5.5,最适温度为45℃。该酶在pH4.9—9.3区域或40℃以下处理30min,酶活力保持稳定。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.357 mmol/L,最大反应速度Vm为10.41μmol/L.min。酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为76.50kJ/mol。金属离子对酶的效应试验表明：Mg^2＋、Ca^2＋和Ba^2＋对酶活力没有影响。Na＋对酶有激活作用,Li^＋、K^＋、Zn^2＋、Hg^2＋、Pb^2＋、Cu^2＋和Al3＋对酶活力表现出不同程度的抑制作用。     

番茄果实中焦磷酸:D-果糖-6-磷酸 1-磷酸转移酶的两种酶型的分离纯化及其特性

用快速蛋白液相层析仪(FPLC)Mono Q柱(HR5/5)分离纯化成熟绿番茄果实中PFP的两种分子酶型及其特性。一种酶型为Q_1,是含两个β-亚基(60kD)的二聚体,比活为5μmol min~(-1) mg~(-1);另一种为Q_2,由四个α-亚基(66kD)和四个β-亚基(60kD)组成八聚体,比活为70.5μmol/min~(-1)·mg~(-1)。Q_1的分子量是120kD,Q_2的分子量介于500kD和530kD之间。用纯化的Q_2制备的抗血清专一地与Q_2起沉淀反应。PFP酶液贮存后,其Q_1/Q_2蛋白量比值增加明显,表明部分Q_2转化为Q_1。Q_1具有催化活力表明PFP的活性中心位于β-亚基。α-亚基可能借增强PFP酶对F2,6P_2的亲和力以提高酶的比活而起调节功能,但是Q_1的活力依赖于F2,6P_2的激活,表明β-亚基处也可能存在F_2,_6P_2的调节位点。Q_2含紧密结合的F2,6P_2分子,并表现出对F2,6P2_的不敏感性,基于此种现象,有必要重新认识PFP对F2,6P_2敏感性的内在实质。     

滑液支原体NADH氧化酶的酶学活性及亚细胞定位研究

【背景】许多研究表明,支原体的NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)不仅在胞浆中发挥生物酶学功能,也存在于细胞膜上发挥黏附宿主细胞功能。【目的】对滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的NOX进行酶学活性及亚细胞定位研究,分析其在MS致病过程中的潜在作用。【方法】对MS的NOX蛋白进行原核表达、纯化,然后对重组MSNOX (rMSNOX)的酶学活性及影响酶活的条件进行研究,测定其酶比活力、米氏常数及最大反应速率,接着用MS阳性血清及制备的rMSNOX兔多克隆抗体,分别与rMSNOX蛋白及MS全菌、膜蛋白和胞浆蛋白进行Western blotting反应,鉴定rMSNOX的免疫原性及其在MS中的分布情况。【结果】在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达rMSNOX蛋白,相对分子质量约为53 kD,并获得纯化的rMSNOX蛋白;酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率V_max为21.8μmol/(L·min),米氏常数K_m     

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶的性质研究

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶是溶解状态的酶。我们制备了四种接有不同配位基或手臂的亲和凝胶,对酶的亲和层析行为作了比较。结果表明,不仅配位基的性质对酶的结合有关,而且手臂的疏水性质也影响酶的结合。用N-甲基吖啶为配位基的凝胶将粗酶制剂纯化了480倍。该酶对碘化硫代乙酰胆碱的米氏常数Km为6.8×10~(-5)M,对抑制剂BW284C51的可逆抑制常数Ks为1.03×10~(-5)M,过量底物使酶活力受到抑制。另外,我们还初步观察到不同季节的材料,其酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离图谱有所差异。     

离子对反相HPLC测定人红细胞PRPP合成酶活性

红细胞PRPP合成酶是红细胞内核苷酸代谢的关键酶,它参与嘌呤核苷酸的从头合成与补救合成途径,催化ATP与5-磷酸核糖（R5P）反应生成PRPP与AMP,而PRPP则是嘌呤嘧啶核苷酸合成途径的一个关键性中间产物．Stocchi等[1]采用离子对反相高效液相色谱法（IPrHPLC）测定红细胞内ATP,ADP．AMP含量,曾获得满意的谱峰分离效果．Sakuma等[2]应用rHPLC法测定了正常人及痛风等患者红细胞的PRPP合成酶活性,我们将Sakuma等的测酶技术与IPrHPLC法相结合,改用单液等度洗脱,达到了操作简便和灵敏、准确的要求．1材料和方法1．1试剂…     

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶的性质研究

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶是溶解状态的酶。我们制备了四种接有不同配位基或手臂的亲和凝胶,对酶的亲和层析行为作了比较。结果表明,不仅配位基的性质对酶的结合有关,而且手臂的疏水性质也影响酶的结合。用N-甲基吖啶为配位基的凝胶将粗酶制剂纯化了480倍。该酶对碘化硫代乙酰胆碱的米氏常数K_m为6.8×10~(-6)M,对抑制剂BW284C51的可逆抑制常数K_4为1.03×10(-6)M,过量底物使酶活力受到抑制。另外,我们还初步观察到不同季节的材料,其酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离图谱有所差异。     

肝癌的生化研究 Ⅰ.3’-甲基-4-二甲基氨基偶氮苯引起大白鼠肝癌癌变过程中核酸嘧啶化合物代谢酶系的变化

肿瘤组织的核酸代谢和正常组织有所不同,已有不少工作证实,Skipper,Bennett等观察到肿瘤组织利用甘氨酸、甲酸等小分子化合物合成核酸嘌呤的能力较正常组织强,而利用嘌呤碱、嘌呤核苷及嘌呤核苷酸的能力则不如正常组织。de Lamirande等发现核酸嘌呤化合物代谢酶系活力在大白鼠Novikoff肝癌组织和正常组织中有明显区别,如黄嘌呤氧化酶和尿酸酶活力在肿瘤组织中完全不能测到。但有关核酸嘧啶化合物在癌组织中代谢的报导则较少,Reichard和Skold曾报告艾氏腹水癌尿嘧啶核苷磷酸