一个枯草杆菌启动子(P_(28-1))对链霉菌分化的影响

亚克隆1.1kb的枯草杆菌启动子P_(28-1)到pUC19上,再亚克隆到以儿茶酚加氧酶为报告基因的链霉菌启动子探测质粒pIJ4083上,构建的重组质粒命名为pIJ4498.用pIJ4498转化天蓝色链霉菌J1501的原生质体,得到了相对于灰色野生型的白色转化子,而用载体pIJ4083转化J1501后得到的转化子是正常的深灰色菌落.经限制性内切酶验证了重组质粒的结构,测定了质粒的稳定性.当pIJ4498转化天蓝色链霉菌的WhiG突变株(C71)后,未观察到任何表型的变化.通过超声波破碎细胞得到的J1501/pIJ4498菌体的蛋白提取液,可使无色的儿茶酚氧化成黄色的2-羟粘糠酸半醛(HMS).而对照株J1501/pIJ4083及C71/pIJ4498菌株的蛋白提取液不能使儿茶酚氧化成黄色的HMS产物.结果表明枯草杆菌的启动子P_(28-1)被天蓝色链霉菌J1501的σ~(whiG) RNA聚合酶所识别,在启动儿茶酚加氧酶报告基因表达的同时,影响了天蓝色链霉菌J1501分化中的孢子形成.     

链霉菌发育控制启动子—P_(TH4)对孢子形成的影响

在原核生物发育分化的分子遗传学研究中,链霉菌因其复杂的分化生命周期,无与伦比的合成次级代谢产物的能力（目前世界上所知的数千种天然抗生素的７０％由链霉菌产生）,使之成为原核生物乃至微生物发育与分化研究的最好模式系统［１］,为研究基因时空表达和阐明分化调…     

链霉菌发育控制启动子—PTH4对孢子形成的影响

在原核生物发育分化的分子遗传学研究中,链霉菌因其复杂的分化生命周期,无与伦比的合成次级代谢产物的能力（目前世界上所知的数千种天然抗生素的７０％由链霉菌产生）,使之成为原核生物乃至微生物发育与分化研究的最好模式系统［１］,为研究基因时空表达和阐明分化调...     

与链霉菌发育分化有关的启动子——PTH4的调控研究

依赖于天蓝色链霉菌分化关键基因——whiG的发育调控启动子(P_TH4)所控制的下游基因被克隆了,用双脱氧链终止法进行了双链测序.结果表明在1597bp的DNA片段中含有一个完整的开读框架(ORF).在计算机的蛋白文库比较中未找到与该基因产物同源的已知蛋白,可能是一个新的蛋白产物.用基因破坏的策略初步研究了该基因的生物学功能,发现该基因的破坏影响了放线紫红素的产生,即与天蓝色链霉菌放线紫红素的生物合成有关.这进一步证明启动子——P_TH4在链霉菌分化中的多级调控作用.     

链霉菌分化调控启动子——PTH4和PTH270的体内转录研究

天蓝色链霉菌分化调控启动子P_TH4和P_TH270被分别亚克隆到链霉菌启动子探针载体pIJ4083后,构建的重组质粒被命名为pIJ4470和pIJ4471.当pIJ4470和pIJ4471转化天蓝色链霉菌的白色分化阻断突变株(C85,C70,C71,C17和C119)后,通过pIJ4083上儿茶酚加氧酶报告基因的表达可知启动子的活性.从构建的重组菌株中进行了总RNA的提取.用同位素标记P_TH4和P_TH270的5’-端制备成了探针,以不同来源的RNA为模板与制备的探针分别进行了DNA-RNA杂交.S1 mapping的结果表明,来自C85/pIJ4470,C85/pIJ4471,C70/pIJ4470,C70/pIJ4471及C17/pIJ4470,C17/pIJ4471菌株的RNA杂交后都给出了较强的阳性杂交信号,而来自C71/pIJ4470,C71/pIJ4471菌株的RNA杂交未出现阳性信号,来自C119/pIJ4470与C119/pIJ4471菌株的RNA杂交后有弱的信号.上述结果表明启动子P_TH4和P_TH270的转录依赖于链霉菌分化关键基因whiG,部分依赖于分化基因whiH,而不依赖于分化基因whiA,whiB及whiI.     

链霉菌启动子及其应用研究进展

链霉菌天然产物因其显著的生物活性一直是新药开发的重要来源,测序技术的发展揭示了链霉菌强大的生物合成潜力。链霉菌中多数次级代谢生物合成基因簇(biosynthetic geneclusters,BGCs)在常规实验条件下表达水平低甚至不表达,这使得相关天然产物的开发受到阻碍。原位激活和异源表达是挖掘链霉菌天然产物的有效方式,启动子作为基因表达的“开关”,在其中发挥着重要作用。因此对启动子的研究可以有效地促进BGCs的激活,从而挖掘新天然产物。本文重点阐述了链霉菌启动子的结构特征及其挖掘表征和设计构建的思路,并列举了链霉菌启动子在天然产物开发中的应用,有望为链霉菌生物合成路径的优化以及全新生物活性物质的发现提供思路和方法学参考。     

变铅青链霉菌启动子的克隆和表达

利用启动子探测质粒pIJ486(Tsr~(?) Neo~(?))将变铅青链霉菌(streptomyces lividans)TK24染色体DNA的BamHI酶切片段插入pIJ486的BamHI位点。获得4个硫链丝菌肽抗性、新霉素抗性的重组质粒。它们分别命名为pMGI(10.6kb)、pMG40(7.6kb)、pMG50(10.8kb)和pMG88(7.92kb)。BamHI酶切分析及再转化试验表明,新霉素抗性的恢复确实来自载体的外源插入序列。用BgⅢ酶切已将pMG40的插入序列缩小到0.78kb的pMG40-2,pMG50的插入序列缩小到2.2kb的pMG50-25,仍保留启动子活性。重组质粒pMG50-25的新霉素抗性水平高达90μg/ml(卡那霉素抗性水平为500μg/ml),表明这是一个活性很强的启动子。     

天蓝色链霉菌孢子形成的关键基因——whiG的诱导表达

与链霉菌分化有关的whiG结构基因已亚克隆到链霉菌表达载体pAK203的tipA启动子下游.该启动子能被硫链丝菌素诱导.whiG基因的诱导表达不仅可使天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71恢复产生孢子的能力,而且也能使天蓝色链霉菌野生型菌株J1501和变铅青链霉菌TK54的孢子形成更为丰满.Western杂交也进一步证实了诱导表达后whiG基因产物——σ~(whiG)产量的增加.这为依赖于σ~(whiG)RNA多聚酶的发育调控启动子体外转录的研究提供了有利条件.     

圈卷产色链霉菌分化及其特性的研究

链霉菌分化的分子生物学研究是一个饶有兴趣并富有挑战性的世界前沿研究课题.在原核生物的分化研究中,主要以枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为模式系统,但枯草杆菌的生命周期尤其是分化过程远比链霉菌简单,不象链霉菌有基质菌丝、气生菌丝、菌丝螺旋和孢子分隔那样的发育分化过程[1].在真核生物中也有分化研究的报道,如构巢曲霉、酵母等.由于真核生物的基因结构比原核生物复杂得多,弄清分化中基因调控的关系就更加困难.因此,选用链霉菌作分化研究的材料有其独一无二的优越性.国际上有关链霉菌的分子生物学研究,近年来主要以链霉菌的抗生素生物合成基因和链霉菌的分化基因两个大的方面作为研究的热点和主攻方向,并展开了一些开拓性的研究.     

枯草芽孢杆菌表达的VP28 对南美白对虾免疫力和抗病毒感染的影响

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P388白血病小鼠胸腺哺育细胞的细胞化学观察

采用ANAE、ACP、β-Gase和PAS细胞化学方法,对接种P388白血病细胞后3天和9天患鼠的胸腺哺育细胞(Thymic nurse cell,TNC)、外周血淋巴细胞及腹水细胞进行了观察,并与对照组加以比较。结果表明,3天组患鼠TNC对三种酶均呈局部阳性反应;TNC内的淋巴细胞(TNC—L)ACF和β-Gase阳性率显著增加,而ANAE阳性率则显著下降;外周血未见异常;患鼠无腹水。9天组患鼠,外周血白细胞总数显著增加,以淋巴细胞为主,淋巴细胞三种酶和PAS的阳性率均显著增高;患鼠腹水明显,其大部分腹水细胞三种酶呈弥漫性强阳性反应,PAS也为强阳性反应;但很难分离到TNC。外周血淋巴细胞和9天组患鼠腹水细胞POX呈阴性反应。对上述结果作了讨论。     

低氧对NG108－15细胞生长及分化的影响

神经母细胞瘤和神经胶质瘤细胞融合的克隆细胞系ＮＧ１０８－１５细胞在含分化剂双丁基环化单磷酸腺苷（ｄＢｆｃＡＭＰ）的培养液培养后分化,成为具神经细胞特征的细胞。本实验利用四唑盐（ＭＴＴ）微量比色法,并结合焦油紫染色,测定和观察细胞的生长及分化状况,研究了低氧（２％Ｏ２＋９３％Ｎ２＋５／ＣＯ２）对未分化的,分化中的和已分化完成的ＮＧ１０８－１５细胞的影响。获得的主要结果是;低氧明显降低未分化细胞增殖和存活率,使分化完成的细胞大量死亡;低氧影响ＮＧ１０８－１５细胞的分化,使细胞在分化中出现体积膨大,突起短等异常特征,经焦油紫染色,胞质中无尼氏体（即不着色）的细胞增多。低氧是否可能使未分化ＮＧ１０８－１５细胞向更多地表达胶质细胞特征的方向分化？将是一个十分有趣的问题。     

盐度对早期链霉菌产生二甲基异莰醇和土臭味素的影响

天津是中国北方重要的渔业生产基地,2006年全市水产养殖面积430 km2,水产品总产量35.5万吨,其中养殖产量30万吨,渔业产值40亿元。天津养鱼池水盐度普遍在2-5,属于寡盐水鱼池,但在该地区采取高密度精养模式生产鱼类普遍存在土腥异味,降低了水产品食用价值和养殖效益。       

西藏植物区系地理区域分异的探讨

本文应用数量统计方法及植物区系分布区型谱图探讨西藏植物区系地理的地域分异。中国-喜马拉雅成分在藏东和藏东南占优势,热带成分集中分布于喜马拉雅南翼的低海拔地区;在高原内部青藏高原成分占统治地位,而中亚成分则在高原的西北部起重要的作用。植物区系成分的这种水平地域分异和西藏境内自东南向西北植被由森林、草甸、草原至荒漠的地带更迭是相吻合的。海拔1800米可以看作是热带成分占优势的垂直系列的上界。根据优势植物区系成分确定的几条界线,西藏可划归如下植物区系区域:古热带植物区印度马来亚植物亚区的喜马拉雅南翼亚地区,泛北极植物区的中国-喜马拉雅亚区和青藏高原亚区。     

阿维链霉菌中aveD基因阻断对阿维菌素合成的影响

利用用于基因破坏的重组质粒pCZ2 (pKC1 1 39∷ 475bpaveD)对阿维菌素 (Avermectin)产生菌阿维链霉菌 (Streptomycesavermitilis) 76- 9的aveD基因进行插入失活 ,将获得的aveD破坏子进行摇瓶发酵和阿维菌素初步提取和HPLC检测 ,发现破坏子仅产生四个主要组分 ,但它们的保留时间分别比Bla、Blb、B2a和B2b的略长。进而将粗提液纯化并获得晶体 ,以UV、IR、NMR ( 1H NMR和13C NMR)和MS进行结构分析 ,并结合HPLC检验 ,证明它们属于C5 氧 阿维菌素B。说明阿维链霉菌的aveD基因破坏 ,不仅丧失了合成阿维菌素A组分的能力 ,也造成了其下游的aveF基因不能表达 ,因此只产生了C5 氧 阿维菌素B。     

甜菜增产菌P10菌株的鉴定

在新疆甜菜块根皮层内分离并筛选到对甜菜具有增产增糖作用的优化菌株Ｐ＿（１０）。通过形态培养征和生理生化特性研究,将该菌株鉴定为短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）。     

牲畜链霉菌异青霉素N合成酶基因的克隆与序列分析

产生含硫卜-内酰胺类抗生素的不同微生物种属间(包括原核和真核)的异青霉素N合成酶(IPNS)基因存在着明显的同源性。利用S. lipmanii IPNS基因探针验证了牲畜链霉菌(S. cattleya)染色体DNA中确实含有与之同源的区带,通过与牲畜链霉菌无活性阻断突变株互补克隆的方法,获得了同时含有硫霉素环化酶及IPNS基因的重组质粒。经基因序列分析表明牲畜链霉菌中IPNS基因,由963bp组成,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,共编码321个氨基酸,所克隆的牲畜链霉菌IPNS基因编码蛋白与已知的S. clavuligerus的IPNS相似性为56％,与S. lipmanii的IPNS相似性为64％。