水稻钙调蛋白基因的克隆及结构分析

钙调蛋白(Calmodulin)是生物细胞内一种重要的调控蛋白,通过其与靶酶的相互作用,控制细胞正常的生长和发育。我们以湖北光敏感核不育水稻cDNA第一条链为模板,参考大麦钙调蛋白基因序列合成5’端和3’端引物,利用多聚酶链式反应(PcR)合成了完整的水稻钙调蛋白cDNA,克隆并测定其序列。结果表明,光敏核不育水稻的钙调蛋白基因由450个桉苷酸组成,共编码148个氨基酸,且与迄今为止在植物领域里发表的大麦及苜蓿的钙调蛋白基因有很高的同源性。在核苷酸序列上与大麦有90％的同源性,与苜蓿有86％的同源性,其编码的148个氨基酸与大麦和苜蓿的差异分别只有1个。这是国际上第一次克隆水稻的钙调蛋白基因。     

灵芝钙调蛋白基因CaM的克隆与功能分析

灵芝是我国传统的食药用真菌,具有广泛的免疫调节功能并含有多种生物活性成分。灵芝酸是灵芝的主要次生代谢产物之一,具有较高商业价值。钙调蛋白（calmodulin,CaM）作为真核生物中重要的Ca ²⁺信使,能够参与生长发育、次生代谢等重要生理过程。本研究通过序列分析发现,灵芝CaM基因序列编码149个氨基酸,与其他物种CaM蛋白高度保守。该蛋白含有4个完整的EF-hand结构域,并且在每个EF-hand结构域中,都含有一个保守的D-x-D基序。进一步构建筛选了灵芝CaM沉默转化子,检测CaM在灵芝生长发育及次生代谢过程中的功能。结果显示,CaM沉默转化子中灵芝酸含量比WT降低约34%。沉默CaM后菌丝生长速率与WT相比降低40%。该结果说明CaM在灵芝生长及次生代谢过程中具有重要作用,为在真菌中研究CaM功能及调控途径提供参考。     

一个钙调蛋白类基因对拟南芥叶片气孔分布的影响

以一个缺磷胁迫诱导的钙调蛋白类基因AtPsiCaM为研究对象,采用拟南芥浸润转基因方法获得了AtPsiCaM基因的35S增强转基因植株。经Northern杂交检测表明,在AtPsiCaM基因的增强转基因株系中,该基因的转录水平明显增强。实验结果表明AtPsiCaM基因降低了增强转基因植株叶片的气孔指数和气孔导度,并且影响了植株的气孔分布。     

钙调蛋白的功能性运动分析

目的:研究钙调蛋白(CaM)结构的动力学行为和运动趋势。方法:利用高斯网络模型(GNM)和各向异性网络模型(ANM),分析CaM在无钙和含钙2种形式下的功能运动。结果:CaM的慢运动模式显示,CaM的构象变化主要表现为2个结构域的运动;2种形式的CaM具有共同的铰链区,铰链区位于分子的中央接头,但二者具有不同的运动趋势。交叉相关图结果显示,CaM结合钙离子后,结构域内的相互作用会增强。结论:GNM和ANM结果可以解释先前报道的实验数据。结果有助于更好地了解CaM的构象转变规律,并会提高对CaM的底物识别和调节活动机制的理解。     

原核生物中的类钙调蛋白

钙是重要的生命元素之一,真核生物中普遍存在介导钙信号的钙调蛋白已有深入的研究,证明钙调蛋白是细胞复杂调控系统中的一个重要成员,但是在原核生物中是否也存在类似的蛋白因子却一直说法不一.自80年代初在大肠杆菌(Escherichia coli)中首次发现类钙调蛋白(calmodulin-like-protein)以来,已在多种原核生物中陆续发现了类钙调蛋白的存在,证明其可能参与了原核生物的孢子形成,细胞分裂,生物固氮,异型胞形成和兰细菌光合作用等多种调控功能.文章综述了近年来这一领域的部分研究成果.     

新疆盐生植物的钙调蛋白基因克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从新疆盐生植物花花柴(Karelinia caspica)、盐爪爪(Kalidium foliadum)和盐桦(Betula halophila)中分别克隆获得了450bp的cDNA片段.基因测序和序列同源性分析的结果表明,所克隆的基因片段均包含了钙调蛋白基因完整的读码框架.新疆花花柴钙调蛋白基因与盐爪爪钙调蛋白基因同源性达86%,盐爪爪与盐桦同源性达86.77%,花花柴与盐桦同源性达85.11%.新疆盐生植物钙调蛋白基因与其它已发表的植物钙调蛋白基因同源性均在80%以上,显示植物钙调蛋白基因具有高度保守性.     

果蝇钙调蛋白和肌球蛋白NINAC相互作用分析

果蝇的视觉信号转导途径是已知的最快的G 蛋白偶联信号通路。这其中涉及到TRP/TRPL通道的开放以及钙离子的内流等一系列反应的形成。NINAC（neither inactivation nor afterpotential C）是一种特异性存在于果蝇感光细胞中的第3类肌球蛋白（Myosin III）,其在终止果蝇的视觉信号转导通路中起着非常重要的作用。NINAC蛋白具有两种亚型：一种是132 kD的蛋白亚型 (p132),另一种则是174 kD的蛋白亚型(p174)。这两种不同的蛋白亚型都具有相同的激酶催化结构域(kinase domain),以及与肌球蛋白相似的马达结构域(motor domain)。但是,它们在C末端却存在着非常大的差异,这其中包括了钙调蛋白结合基序(IQ motif)。NINAC的这两种蛋白亚型在果蝇的感光细胞中的定位以及作用有很大不同,尤其是在与钙调蛋白的相互作用方面。钙调蛋白结合基序与钙调蛋白（CaM）之间的相互作用对于果蝇的视觉信号通路具有重要的意义：NINAC结合钙调蛋白能力的缺失将导致果蝇的视觉传导缺陷。本文通过蛋白共表达的方法,成功表达并纯化得到了不同版本的NINAC与钙调蛋白的蛋白复合物。静态光散射的结果表明,在Ca2+存在情况下,p174蛋白可以结合2个Ca2+-CaM,而p132只结合1个Ca2+-CaM。通过分析型凝胶过滤以及等温量热滴定技术,进一步鉴定了p174及p132的IQ2（第2个钙调蛋白结合基序）序列与Ca2+ CaM的相互作用。通过序列分析及进一步的突变实验发现,p174 IQ2中的3个疏水氨基酸（F1083,F1086 和 L1092）对于钙调蛋白的结合非常重要,并导致了p174与p132蛋白和Ca2+ CaM结合能力的差异。本文的研究提供了NINAC与Ca2+-CaM相互作用的生化机制,将为进一步在果蝇视觉信号通路中深入研究CaM是如何调节NINAC的体内功能实验打下基础。     

烟草渗调蛋白基因的分离克隆及序列分析

参照国外报道的渗调蛋白基因序列,自行设计并合成了一对寡核苷酸引物,通过ＰＣＲ技术从云南地方栽培的烤烟品种“红花大金元”基因组ＤＮＡ中直接扩增出了其全编码序列。ＰＣＲ产物纯化后直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统中,转化大肠杆菌ＤＨ５α,在Ｘｇａｌ平板上筛选白色菌落,经ＳｐｈＩ和ＳａｃＩ双酶切,鉴定所得的重组质粒中含有７５３ｂｐ左右的ＰＣＲ扩增片段。采用双链双脱氧法定序分析表明所克隆的渗调蛋白基因编码区序列与国外迄今所报道的两个株系的序列完全一致,提示了该基因在进化上的保守性     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

用非放射性原位杂交和免疫金染色在豌豆间期染色质内显示的rDNA的分布

以异羟基洋地黄毒甙标记的ｒＲＮＡ为探针,通过与植物根尖分生组织区振动切片中的ｒＤＮＡ原位杂交,结合免疫金染色及银加强金处理研究了豌豆间期染色质中ｒＤＮＡ的分布。研究结果清楚地显示供试植物间期细胞内有１－５个显著的ｒＲＮＡ探针结合位点,其中显示４个结合位点的细胞占６０．６％,少于和多于４个结合位点的细胞分别上３７．９％和１．１４％。在显示４个结合位点的细胞核内,它们分别按照２：１、３：１和２：１：１     

豌豆细胞核仁中rDNA的超微定位和排布构型

利用细胞化学DNA特异染色法——NAMA-Ur特异染色法对豌豆细胞核仁中rDNA的位置及其排布构型进行了原位观察。结果表明,核仁中的rDNA位于纤维中心(FC)以及FC与致密纤维组分的交界处,以环绕FC的形式排布。不同位置的rDNA成分都具有集缩和解集缩两种形态结构,核仁外的核仁伴随染色质经过核仁通道进入核仁,沿FC周边排列,与其中的DNA相连。     

用非放射性原位杂交在同一张切片上同时在光学和电子显微镜下显示的豌豆rDNA的分布(简报)

原位杂交目前已成为研究各类组织或细胞内DNA或RNA定位最有效的手段,特别是在发育生物学领城,对于研究基周的表达和修饰更具有重要意义。旱期的原位杂交主要是在     

豌豆球蛋白及其亚基的分离提纯

本文详细地叙述了提取、分离、提纯豌豆球蛋白及其亚基的方法:用硼酸钠缓冲液提取豌豆球蛋白,用85%饱和度硫酸铵沉淀除去其它蛋白质杂质,再用凝胶柱进一步提纯;提纯的豌豆球蛋白通过DE_(52)-纤维素阴离子树脂柱(8M尿素作为变性分离试剂)和S_(200)凝胶柱(70%甲酸作为变性分离试剂)则可分离出豌豆球蛋白的各个亚基;试验结果还表明:在pH8.5时,33,000的亚基携带少量负电荷;而12,000的亚基携带大量负电荷。